췌장 β세포에서 미토파지 플럭스를 조사하기 위한 보완적 접근법
Summary
이 프로토콜은 췌장 β 세포에서 미토파지의 정량적 분석을 위한 두 가지 방법을 설명합니다: 첫 번째는 세포 투과성 미토콘드리아 특이적 염료의 조합이고, 두 번째는 유전적으로 인코딩된 미토파지 리포터입니다. 이 두 기술은 상호 보완적이며 특정 요구 사항에 따라 배포할 수 있으므로 미토콘드리아 품질 관리를 정량적으로 처리하는 데 유연성과 정밀도를 제공합니다.
Abstract
미토파지는 최적의 미토콘드리아 기능을 유지하는 데 필요한 품질 관리 메커니즘입니다. 기능 장애β세포 미토파지는 인슐린 분비를 불충분하게 만듭니다. 미토파지의 고급 정량적 평가는 종종 유전자 보고자의 사용을 필요로 합니다. 유세포 분석을 통해 미토파지를 정량화하기 위한 미토콘드리아 표적 pH 민감성 이중 여기 비율계량 프로브를 발현하는 mt-Keima 마우스 모델은 β 세포에서 최적화되었습니다. 산성 대 중성 mt-Keima 파장 방출의 비율은 미토파지를 강력하게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 유전자 미토파지 리포터를 사용하는 것은 복잡한 유전자 마우스 모델 또는 주요 인간 섬과 같이 transfection하기 어려운 세포로 작업할 때 어려울 수 있습니다. 이 프로토콜은 MtPhagy를 사용하여 1차 섬에서 β세포 미토파지를 정량화하는 새로운 보완 염료 기반 방법을 설명합니다. MtPhagy는 미토콘드리아에 축적되어 미토콘드리아가 미토파지 중 리소좀과 같은 낮은 pH 환경에 있을 때 형광 강도를 증가시키는 pH에 민감한 세포 투과성 염료입니다. MtPhagy 염료를 β세포를 선택하는 Zn2+ 표지자인 Fluozin-3-AM 및 테트라메틸로다민, 에틸 에스테르(TMRE)와 결합하여 미토콘드리아 막 전위를 평가함으로써 유세포 분석을 통해 β세포에서 미토파지 플럭스를 특이적으로 정량화할 수 있습니다. 이 두 가지 접근 방식은 매우 상호 보완적이어서 수많은 β세포 모델에서 미토콘드리아 품질 관리를 평가하는 데 유연성과 정확성을 제공합니다.
Introduction
췌장 β세포는 대사 요구를 충족시키기 위해 인슐린을 생산하고 분비하며, β세포 기능 장애는 제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병 모두에서 고혈당증과 당뇨병 발병의 원인이 됩니다. β-세포는 미토콘드리아 에너지 및 대사 출력을 통해 포도당 대사와 인슐린 분비를 결합하며, 이는 기능적 미토콘드리아 질량 1,2,3의 예비력에 의존합니다. β세포는 최적의 β세포 기능을 유지하기 위해 미토콘드리아 품질 관리 메커니즘에 의존하여 노화되거나 손상된 미토콘드리아를 제거하고 기능적인 미토콘드리아 질량을 보존합니다4. 선택적 미토콘드리아 자가포식(mitophagy)은 미토콘드리아 품질 관리 경로의 핵심 구성 요소입니다.
살아있는 세포의 미토파지 평가는 종종 미토파지 중에 발생하는 미토콘드리아 pH의 변화에 의존합니다. 미토콘드리아는 약알칼리성 pH를 가지고 있으며, 건강한 미토콘드리아는 일반적으로 pH 중성 세포질에 존재합니다. 미토파지(mitophagy) 동안, 손상되거나 기능장애를 일으킨 미토콘드리아는 선택적으로 자가포식체에 통합되고 결국 산성 리소좀 내에서 제거된다5. mt-Keima6, mitoQC7 및 CMMR8과 같은 여러 in vivo 형질전환 미토파지 리포터 마우스 모델과 Cox8-EGFP-mCherry 플라스미드9와 같은 형질주입 가능한 미토파지 프로브는 이러한 pH 변화를 활용하여 미토파지의 정량적 평가를 제공합니다. mt-Keima pH 민감성 이중 여기 비율계량 프로브를 발현하는 형질전환 마우스의 사용은 유세포 분석10,11을 통해 섬 및 β세포의 미토파지 평가에 최적화되었습니다. 산성 대 중성 mt-Keima 파장 방출의 비율(산성 561nm와 중성 480nm 여기의 비율)은 미토파지 6,12를 강력하게 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 mt-Keima 형질전환 마우스10,11에서 분리한 일차 섬 및 β-세포에서 미토파지 플럭스를 평가하기 위한 최적화된 접근법을 설명합니다. mt-Keima는 매우 민감한 프로브이지만 복잡한 동물 사육 계획이나 세포의 형질주입이 필요하며, 이는 다른 유전자 모델 또는 주요 인간 섬과 함께 작업할 때 종종 어려울 수 있습니다. 또한 중성 및 산성 세포 집단을 식별하기 위해 여러 형광 레이저 및 검출기를 사용하면 다른 형광 리포터의 조합 사용을 제한할 수 있습니다.
이러한 문제를 극복하기 위해 이 프로토콜은 또한 분리된 마우스 섬의 β세포에서 미토파지를 강력하게 검출하기 위한 보완적인 단일 형광 채널, 염료 기반 방법을 설명합니다. MtPhagy 방법이라고 하는 이 접근법은 세 가지 세포 투과성 염료의 조합을 사용하여 β 세포를 선택하고, 미토파지(mitophagy)를 활발하게 진행 중인 세포 집단을 정량화하고, 미토콘드리아 막 전위(MMP 또는 Δψm)를 동시에 평가합니다.
이 염료 중 첫 번째는 Ex/Em 494/516 nm13을 갖는 세포 투과성 Zn2+ 지시체인 Fluozin-3-AM입니다. 마우스 섬은 α, β, δ 및 PP 세포를 포함하여 기능적으로 구별되는 세포의 이질적인 집단으로 구성됩니다. β-세포는 마우스 섬 내 세포의 약 80%를 구성하며 인슐린 과립14,15 내의 높은 Zn2+ 농도로 인해 다른 섬 세포 유형과 구별할 수 있어 β 세포를 Fluozin-3-AM높은 집단으로 식별할 수 있습니다. 화학 결합을 통해 미토콘드리아에 고정되고 약한 형광을 방출하는 pH에 민감한 염료인 MtPhagy 염료도 이 프로토콜16에서 활용됩니다. 미토파지 유도 시 손상된 미토콘드리아가 산성 리소좀에 통합되고 MtPhagy 염료는 낮은 pH 환경(Ex/Em 561/570-700nm) 내에서 형광 강도를 증가시킵니다.
또한 테트라메틸로다민, 에틸 에스테르(TMRE)를 사용하여 MMP를 평가합니다. TMRE는 세포 투과성 양전하를 띤 염료(Ex/Em 552/575 nm)로, 막 전위17에 의해 유지되는 상대적인 음전하로 인해 건강한 미토콘드리아에 의해 격리됩니다. 손상되거나 건강하지 않은 미토콘드리아는 막 전위를 소멸시켜 TMRE를 격리하는 능력을 감소시킵니다. 이러한 염료를 함께 활용하면 미토파지를 겪는 β 세포를 유세포 분석을 통해 FluozinhighMtPhagyhighTMRElow population으로 식별할 수 있습니다. 미토파지는 정적 과정이 아닌 동적 과정이기 때문에 이 프로토콜은 MMP18의 소산 후 미토파지를 유도하는 K+-이온단인 발리노마이신을 사용하여 미토파지 플럭스를 평가하도록 최적화되었습니다. valinomycin의 존재와 부재 상태에서 미토파지를 비교하면 다양한 샘플 그룹에서 미토파지 플럭스를 평가할 수 있습니다.
현재 접근 방식의 염료 기반 특성으로 인해 인간 섬 및 기타 transfection이 어려운 세포 유형으로 외삽할 수 있으며 mt-Keima 프로토콜과 달리 복잡한 동물 육종 계획의 필요성을 피할 수 있습니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 목표는 두 가지 독립적인 유세포 분석 기반 방법을 통해 단일 세포 수준에서 β 세포의 미토파지를 정량화하는 것입니다. 종합하면, 이 프로토콜은 미토콘드리아 품질 관리의 정량적 연구에서 정확성과 유연성을 모두 허용하는 두 가지 강력하고 보완적인 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 해리된 1차 마우스 섬에서 미토파지 플럭스를 정량화하기 위한 두 가지 보완적인 방법을 설명했습니다. mt-Keima 방법을 사용하여 미토파지의 증가는 산성(561nm)/중성(405nm) 세포의 증가된 비율로 정량화된 반면, MtPhagy 방법에서는 증가된 미토파지 플럭스가 FluozinhighMtPhagy높은TMRE낮은 세포 집단의 증가로 정량화되었습니다. 이러한 방법을 사용하면 미토파지 플?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.L-D. NIH(T32-AI007413 및 T32-AG000114)의 지원을 인정합니다. SAS는 JDRF(COE-2019-861), NIH(R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), 재향군인회(I01 BX004444), Brehm 가족 및 Anthony 가족의 지원을 인정합니다.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher Scientific | D1306 | DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 317275 | |
| Fatty Acid Free heat shock BSA powder | Equitech | BAH66 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| Fluozin-3AM | Thermofisher Scientific | F24195 | 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Phosphate buffered saline, 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Sodium Pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-070 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] | Anaspec | AS-88061 | TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock. |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock. |
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