Komplementære tilnærminger for å forhøre mitofagifluks i bukspyttkjertelen β-celler

Summary

Denne protokollen skisserer to metoder for kvantitativ analyse av mitofagi i bukspyttkjertelen β-celler: For det første en kombinasjon av cellepermeable mitokondrie-spesifikke fargestoffer, og for det andre, en genetisk kodet mitofagi reporter. Disse to teknikkene er komplementære og kan distribueres basert på spesifikke behov, noe som gir fleksibilitet og presisjon i kvantitativt adressering av mitokondriell kvalitetskontroll.

Abstract

Mitophagy er en kvalitetskontrollmekanisme som er nødvendig for å opprettholde optimal mitokondriell funksjon. Dysfunksjonell β-celle mitofagi resulterer i utilstrekkelig insulinfrigivelse. Avanserte kvantitative vurderinger av mitofagi krever ofte bruk av genetiske reportere. Mt-Keima-musemodellen, som uttrykker en mitokondrie-målrettet pH-sensitiv dual-excitasjonsratiometrisk sonde for kvantifisering av mitofagi via flowcytometri, er optimalisert i β-celler. Forholdet mellom sure og nøytrale mt-Keima bølgelengdeutslipp kan brukes til å kvantifisere mitofagi robust. Imidlertid kan bruk av genetiske mitofagireportere være utfordrende når du arbeider med komplekse genetiske musemodeller eller vanskelig å transfektere celler, for eksempel primære menneskelige øyer. Denne protokollen beskriver en ny komplementær fargestoffbasert metode for å kvantifisere β-celle mitofagi i primære øyer ved hjelp av MtPhagy. MtPhagy er et pH-følsomt, cellepermeabelt fargestoff som akkumuleres i mitokondriene og øker fluorescensintensiteten når mitokondrier er i lave pH-miljøer, som lysosomer under mitofagi. Ved å kombinere MtPhagy-fargestoffet med Fluozin-3-AM, en Zn²⁺ -indikator som selekterer for β-celler, og tetrametylrhodamin, etylester (TMRE) for å vurdere mitokondriemembranpotensialet, kan mitofagifluks kvantifiseres spesifikt i β-celler via flowcytometri. Disse to tilnærmingene er svært komplementære, noe som gir fleksibilitet og presisjon i vurderingen av mitokondriell kvalitetskontroll i mange β-cellemodeller.

Introduction

Bukspyttkjertel β-celler produserer og utskiller insulin for å møte metabolske krav, og β-celle dysfunksjon er ansvarlig for hyperglykemi og diabetesutbrudd i både type 1 og type 2 diabetes. β-celler kobler glukosemetabolisme med insulinsekresjon via mitokondriell energetikk og metabolsk utgang, som avhenger av en reserve av funksjonell mitokondriemasse ^1,2,3. For å opprettholde optimal β-cellefunksjon er β-cellene avhengige av mitokondrielle kvalitetskontrollmekanismer for å fjerne gamle eller skadede mitokondrier og bevare funksjonell mitokondriemasse⁴. Selektiv mitokondriell autofagi, også kjent som mitofagi, er en nøkkelkomponent i mitokondriell kvalitetskontrollvei.

Vurderinger av mitofagi i levende celler er ofte avhengige av endringer i mitokondriell pH som oppstår under mitofagi. Mitokondrier har en svakt alkalisk pH, og sunne mitokondrier ligger normalt i den pH-nøytrale cytosolen. Under mitofagi blir skadede eller dysfunksjonelle mitokondrier selektivt innlemmet i autofagosomer og til slutt ryddet i sure lysosomer⁵. Flere in vivo transgene mitophagy reportermusemodeller, som mt-Keima⁶, mitoQC⁷ og CMMR⁸, samt transfektable mitofagiprober, som Cox8-EGFP-mCherry plasmid⁹, bruker denne pH-endringen for å gi kvantitative vurderinger av mitofagi. Bruk av transgene mus som uttrykker den mt-Keima pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe har blitt optimalisert for mitofagivurderinger i øyer og β-celler via flowcytometri^10,11. Forholdet mellom sure og nøytrale mt-Keima bølgelengdeutslipp (forholdet mellom sur 561 nm og nøytral 480 nm eksitasjon) kan brukes til å kvantifisere mitofagi ^6,12.

Denne protokollen beskriver en optimalisert tilnærming for å vurdere mitofagifluks i primære øyer og β-celler isolert fra mt-Keima transgene mus^10,11. Mens mt-Keima er en svært følsom sonde, krever det enten kompliserte dyreavlsordninger eller transfeksjon av celler, noe som ofte kan være utfordrende når man arbeider i kombinasjon med andre genetiske modeller eller med primære menneskelige øyer. I tillegg kan bruk av flere fluorescenslasere og detektorer for å identifisere nøytrale og sure cellepopulasjoner begrense den kombinatoriske bruken av andre fluorescerende reportere.

For å overvinne disse utfordringene beskriver denne protokollen også en komplementær, enkelt fluorescerende kanal, fargestoffbasert metode for robust påvisning av mitofagi i β-celler fra isolerte museøyer. Denne tilnærmingen, referert til som MtPhagy-metoden, benytter en kombinasjon av tre cellepermeable fargestoffer for å velge for β-celler, kvantifisere cellepopulasjonene som aktivt gjennomgår mitofagi og vurdere mitokondriemembranpotensial (MMP eller Δψm) samtidig.

Den første av disse fargestoffene er Fluozin-3-AM, en cellegjennomtrengelig Zn²⁺ indikator med en Ex / Em 494/516 nm¹³. Museøyer omfatter en heterogen populasjon av funksjonelt distinkte celler, inkludert α-, β-, δ- og PP-celler. β-celler utgjør omtrent 80% av cellene i museøya og kan skilles fra andre øycelletyper på grunn av deres høye Zn²⁺ konsentrasjon i insulingranulat^14,15, noe som muliggjør identifisering av β-celler som Fluozin-3-AM^høy populasjon. MtPhagy-fargestoffet, et pH-følsomt fargestoff som immobiliseres på mitokondrier via en kjemisk binding og avgir svak fluorescens, brukes også i denne protokollen¹⁶. Ved mitofaginduksjon inkorporeres skadede mitokondrier i det sure lysosomet, og MtPhagy-fargestoffet øker fluorescensintensiteten i det lave pH-miljøet (Ex / Em 561/570-700 nm).

I tillegg brukes tetrametylrhodamin, etylester (TMRE), til å vurdere MMP. TMRE er et cellegjennomtrengelig positivt ladet fargestoff (Ex / Em 552 / 575 nm) som er sekvestrert av sunne mitokondrier på grunn av den relative negative ladningen som opprettholdes av membranpotensialet¹⁷. Skadede eller usunne mitokondrier sprer membranpotensialet, noe som resulterer i redusert evne til å binde TMRE. Ved å bruke disse fargestoffene sammen, kan β-celler som gjennomgår mitofagi identifiseres som Fluozin^høyMtPhagy^høyTMRE^lav populasjon via flowcytometri. Siden mitofagi er en dynamisk snarere enn statisk prosess, ble denne protokollen optimalisert for å vurdere mitofagifluks ved bruk av valinomycin, en K ⁺-ionofor som induserer mitofagi etter spredning av MMP¹⁸. Sammenligning av mitofagi i nærvær og fravær av valinomycin muliggjør vurdering av mitofagifluks i forskjellige prøvegrupper.

Den fargebaserte naturen til den nåværende tilnærmingen gjør det mulig å ekstrapolere til menneskelige øyer og andre vanskelig å transfektere celletyper og omgå behovet for kompliserte dyreavlsordninger, i motsetning til mt-Keima-protokollen. Det overordnede målet med denne protokollen er å kvantifisere mitofagi i β-celler på encellenivå via to uavhengige flowcytometribaserte metoder. Til sammen beskriver denne protokollen to kraftige og komplementære metoder som muliggjør både presisjon og fleksibilitet i den kvantitative studien av mitokondriell kvalitetskontroll.

Protocol

Dyrestudiene presentert i denne protokollen ble gjennomgått og godkjent av University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. Tjue uker gamle mannlige C57BL / 6J-mus, på enten en 15-ukers vanlig fettdiett (RFD) eller fettfattig diett (HFD), ble brukt til denne studien. 1. Vurdering av mitofagi via fargestoffbasert MtPhagy tilnærming (metode 1) Mus holme forberedelse og behandlingUtfør holmekultur og valinomycineksponering ved å følge tr…

Representative Results

Vurdering av mitofagi via fargestoffbasert MtPhagy-tilnærmingDenne fargestoffbaserte tilnærmingen ble optimalisert for å analysere mitofagifluks i primære mus β-celler uten behov for en genetisk reporter, ved hjelp av Fluozin-3-AM, TMRE og MtPhagy samt DAPI for å utelukke døde celler. Ved å parre disse fargestoffene med valinomycin for å indusere mitofagi, skisserer denne protokollen en fargestoffbasert metode for selektivt å måle mitofagifluks i primære mus β-celler18<…

Discussion

Denne protokollen beskrev to komplementære metoder for å kvantifisere mitofagifluks i dissosierte primære museøyer. Ved hjelp av mt-Keima-metoden ble en økning i mitofagi kvantifisert som et økt forhold mellom sure (561 nm) / nøytrale (405 nm) celler, mens i MtPhagy-metoden ble økt mitofagifluks kvantifisert som en økning i Fluozin^høyMtPhagy^høyTMRE^lav cellepopulasjon. Disse metodene tillater raske, kvantitative og β-cellespesifikke vurderinger av mitofagifluks.

<p class="j…

Materials

Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Attune NxT Flow Cytometer	Thermofisher Scientific	A24858
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermofisher Scientific	D1306	DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder	Equitech	BAH66
Fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108
Fluozin-3AM	Thermofisher Scientific	F24195	100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140-122	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x	Fisher Scientific	BP399-20	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x)	Life Technologies	11360-070	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]	Anaspec	AS-88061	TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermofisher Scientific	25300054
Valinomycin	Sigma	V0627	Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.