Ett omfattande tillvägagångssätt för att analysera cellkomponenterna i cerebrala blodproppar
Summary
Denna studie beskriver en snabb och effektiv metod för cellkomponentanalys av cerebrala blodproppar genom proppupplösning, cellfärgning och rutinmässig blodundersökning.
Abstract
Cerebral trombos, en blodpropp i en hjärnartär eller ven, är den vanligaste typen av hjärninfarkt. Studiet av cellkomponenterna i hjärnans blodproppar är viktigt för diagnos, behandling och prognos. De nuvarande metoderna för att studera cellkomponenterna i blodpropparna är dock huvudsakligen baserade på in situ-färgning , vilket är olämpligt för omfattande studier av cellkomponenterna eftersom cellerna är tätt inlindade i blodpropparna. Tidigare studier har framgångsrikt isolerat ett fibrinolytiskt enzym (sFE) från Sipunculus nudus, som kan bryta ner det tvärbundna fibrinet direkt och frigöra cellkomponenterna. Denna studie etablerade en omfattande metod baserad på sFE för att studera cellkomponenterna i cerebral trombos. Detta protokoll inkluderar proppupplösning, cellfrigöring, cellfärgning och rutinmässig blodundersökning. Enligt denna metod kunde cellkomponenterna studeras kvantitativt och kvalitativt. De representativa resultaten av experiment med denna metod visas.
Introduction
Cerebrovaskulär sjukdom är en av tre stora sjukdomar som kan hota människors hälsa, bland vilka ischemisk cerebrovaskulär sjukdom står för mer än 80%. Cerebral trombos och cerebral ventrombos är de mest drabbade ischemiska cerebrovaskulära sjukdomarna idag, främst orsakade av cerebrala blodproppar 1,2. Om behandlingen inte görs på rätt sätt kommer den att ha höga funktionshinder och dödlighet och en hög återfallsfrekvens efter utskrivning3.
På senare tid har ett växande antal studier visat att cellkomponenterna i hjärnans blodproppar är nära korrelerade med diagnos, behandling och prognos av cerebral trombos 4,5,6. Därför är tillgången till data om trombernas sammansättning, särskilt cellkomponenterna, viktig för klinisk diagnos och behandling. Tyvärr kan de metoder som för närvarande finns tillgängliga inte analysera blodproppskomponenten kvantitativt och kvalitativt. Till exempel kan Martius Scarlett Blue-baserad in-situ-färgning bara studera de röda/vita blodkropparna i vissa skivor av propp7. Immunohistokemi (IHC) baserad in-situ färgning kan endast studera begränsade blodkomponenter i vissa delar av blodproppen med hjälp av deras antikroppar8. De mikroskopiska bildbaserade metoderna är endast intresserade av den specifika strukturen hos propp9. Dessutom är alla dessa metoder mödosamma och tidskrävande10. Hittills har procedurerna för kvantitativ och kvalitativ studie av cerebrala trombicellskomponenter inte rapporterats. Det är allmänt erkänt att det tvärbundna fibrinet tätt lindar in blodkropparna i blodpropparna11. Följaktligen är den specifika nedbrytningen av det tvärbundna fibrinet och frisättningen av de intakta cellerna avgörande för en korrekt analys av cellkomponenterna.
Tidigare arbeten isolerade ett fibrinolytiskt enzym från Sipunculus nudus (sFE), som kan bryta ned fibrinet specifikt och snabbt12. Här föreslogs en metod för att analysera cellkomponenterna i cerebrala trombi baserat på den unika aktiviteten hos sFE. Detta protokoll använde sFE för att bryta ned fibrinet i blodproppar först och analyserade sedan cellkomponenterna genom Wright’s Staining och rutinmässig blodundersökning13,14. Enligt denna metod kan cellkomponenterna i cerebrala tromber studeras kvantitativt och kvalitativt. Detta enkla och effektiva protokoll kan användas för analys av cellkomponenter i andra blodproppar.
Protocol
Representative Results
Discussion
sFE är ett fibrinolytiskt medel som kan bryta ned fibrinet direkt och effektivt12,16. Här användes sFE för att bryta ned det tvärbundna fibrinet i hjärnblodpropparna, frigöra de inneslutna cellerna i koapelarna och analysera cellkomponenterna i blodpropparna kvalitativt och kvantitativt. Mikroskopidata och rutinmässig blodundersökning indikerade att de inneslutna cellerna frigjordes från blodpropparna. Celltyperna och strukturerna hos de frisatta celler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning finansierades av Science and Technology Bureau of Xiamen City (3502Z20227197) och Science and Technology Bureau of Fujian Province (No. 2019J01070, No.2021Y0027).
Materials
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
References
- Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
- Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
- Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
- Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
- Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
- Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
- Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
- Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536 (2021).
- Abbasi, M., et al. Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization. Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).
- C W Francis, a., Marder, V. J. Concepts of clot lysis. Annual Review of Medicine. 37 (1), 187-204 (1986).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , (2019).
- Fotso Fotso, A., Drancourt, M. Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments. Front Public Health. 3, 254 (2015).
- Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446 (2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. Journal of Visualized Experiments. 196, e65631 (2023).
- Ge, Y. H., et al. A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus. International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).
- Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).
