Estrazione del DNA di diatomee da campioni d'acqua e tessuti
Summary
Questo articolo descrive un protocollo per l’estrazione del DNA delle diatomee utilizzando un kit di estrazione del DNA comune modificato.
Abstract
Il test delle diatomee è un mezzo ausiliario essenziale nella pratica forense per determinare se il cadavere è annegato in acqua e per dedurre il luogo dell’annegamento. Il test delle diatomee è anche un importante contenuto di ricerca nel campo dell’ambiente e del plancton. La tecnologia di analisi della biologia molecolare delle diatomee, che si concentra sul DNA delle diatomee come oggetto di ricerca primario, è un nuovo metodo di test delle diatomee. L’estrazione del DNA delle diatomee è alla base dei test molecolari delle diatomee. Attualmente, i kit comunemente usati per l’estrazione del DNA delle diatomee sono costosi, il che aumenta il costo della ricerca correlata. Il nostro laboratorio ha migliorato il kit generale di estrazione rapida del DNA genomico del sangue intero e ha ottenuto un effetto soddisfacente di estrazione del DNA delle diatomee, fornendo così una soluzione alternativa economica e conveniente per l’estrazione del DNA basata su perle di vetro per la ricerca correlata. Il DNA di diatomee estratto utilizzando questo protocollo potrebbe soddisfare molte applicazioni a valle, come la PCR e il sequenziamento.
Introduction
Nella pratica forense, determinare se un cadavere trovato in acqua annegava o è stato gettato in acqua dopo la morte è essenziale per la corretta risoluzione del caso1. È anche una delle questioni difficili che devono essere risolte con urgenza nella pratica forense2. Le diatomee sono abbondanti nell’ambiente naturale (soprattutto nell’acqua)3,4. Nel processo di annegamento, a causa dell’ipossia e della risposta allo stress, le persone avranno intensi movimenti respiratori e inaleranno una grande quantità di liquido di annegamento. Pertanto, le diatomee nell’acqua entrano nel polmone con il liquido di annegamento e alcune diatomee possono entrare nella circolazione sanguigna attraverso la barriera alveolare-capillare e diffondersi agli organi interni con il flusso sanguigno 5,6. Il rilevamento di diatomee nei tessuti interni e negli organi come il polmone, il fegato e il midollo osseo è una forte evidenza di annegamento prima della morte 7,8. Attualmente, l’analisi forense delle diatomee si basa principalmente su metodi di analisi morfologici. Dopo una serie di pre-digestioni del tessuto, vengono effettuate al microscopio le stime morfologiche qualitative e quantitative delle diatomee non digerite. Durante questo periodo, è necessario utilizzare reagenti pericolosi e dannosi per l’ambiente come l’acido nitrico. Questo processo richiede molto tempo e richiede ai ricercatori una solida competenza tassonomica e una vasta esperienza. Tutto ciò comporta alcune sfide per il personale forense9. La tecnologia di test del DNA delle diatomee è una nuova tecnologia per il test delle diatomee sviluppata negli ultimi anni 10,11,12. Questa tecnologia realizza l’identificazione delle specie delle diatomee analizzando la composizione specifica della sequenza di DNA delle diatomee13,14. La tecnologia PCR e la tecnologia di sequenziamento sono metodi tecnici comunemente usati, ma la loro base è l’estrazione di successo del DNA dalle diatomee. Tuttavia, le diatomee hanno una struttura speciale diversa da quella di altri organismi, rendendo diverse anche le loro tecniche di estrazione del DNA.
La parete cellulare della diatomea ha un alto grado di silicizzazione e il suo componente principale è il biossido di silicio 15,16,17. La parete cellulare silicea è molto dura e deve essere distrutta prima di estrarre il DNA. I normali kit di estrazione del DNA sono spesso difficili da utilizzare direttamente per l’estrazione del DNA delle diatomee perché non possono distruggere il guscio siliceo delle diatomee18. Pertanto, la distruzione del guscio siliceo delle diatomee è uno dei principali problemi tecnici da risolvere nell’estrazione del DNA delle diatomee.
Allo stesso tempo, poiché il numero di diatomee contenute nei campioni di ricerca forense, che si tratti di campioni d’acqua o di organi e tessuti di corpi annegati, è spesso limitato, è necessario arricchire le diatomee. L’essenza dell’arricchimento è la separazione delle sostanze. Mentre si cerca di raccogliere le diatomee, ridurre al minimo il contenuto di altri componenti materiali (componenti interferenti). Nel lavoro forense, i laboratori utilizzano spesso metodi di arricchimento della centrifugazione o della filtrazione a membrana per separare le cellule delle diatomee19. Tuttavia, poiché le apparecchiature di pompaggio del vuoto non sono ampiamente utilizzate, il metodo di arricchimento della membrana non viene spesso utilizzato nei normali laboratori forensi primari. Quindi, il metodo di centrifugazione è ancora comunemente l’arricchimento di diatomee nei laboratori forensi20.
L’estrazione del DNA dalle diatomee è attualmente utilizzata principalmente nella pratica forense e ci sono limitazioni significative alla sua applicazione. Attualmente, ci sono pochi kit di estrazione del DNA di diatomee utilizzati nella scienza forense sul mercato e sono generalmente costosi21. Questo articolo fornisce un metodo di estrazione del DNA delle diatomee migliorato, rendendo l’estrazione del DNA delle diatomee semplice, conveniente ed economica. Ciò aumenta l’applicazione dei successivi test di biologia molecolare delle diatomee e può risolvere meglio i problemi legati all’annegamento in medicina legale attraverso il test delle diatomee. Questo metodo rompe le pareti cellulari silicee delle diatomee aggiungendo perle di vetro e impostando un tempo appropriato per il vortice. In questo modo, la proteinasi K e la soluzione di legame lisano rapidamente le cellule e inattivano vari enzimi nelle cellule. Il DNA genomico viene assorbito nella membrana della matrice nella colonna di adsorbimento e infine eluito dal tampone di eluizione. Un kit di estrazione genica del sangue intero così migliorato migliora l’effetto di estrazione del DNA delle diatomee del kit di sangue nei materiali di esame forense, riduce il costo dell’estrazione del DNA delle diatomee nella pratica forense e può essere applicato meglio alla ricerca forense di base.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le cellule di diatomee sono protette da pareti cellulari silicee dure17 e questa struttura deve essere distrutta per estrarre il DNA delle diatomee. I kit ordinari non distruggono facilmente il guscio siliceo delle diatomee; quindi è difficile estrarre con successo il DNA21 delle diatomee. Il nostro laboratorio ha migliorato il kit di estrazione del DNA sanguigno più comunemente usato, aggiungendo perle di vetro di diversi diametri e diversi rapporti di massa nel processo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) e dall’Academician Innovation Platform Scientific Research Project della provincia di Hainan (YSPTZX202134).
Materials
| Binding Buffer | BioTeke | B010006022 | rapidly lysing cells |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotechnology | TW21109197 | reverse primer |
| Elution buffer | BioTeke | B010006022 | A low-salt elution buffer washes off the DNA |
| Glass bead | Yingxu Chemical Machinery(Shanghai) | 70181000 | Special glass beads for dispersing and grinding |
| Import adsorption column | BioTeke | B2008006022 | Adsorption column with silica matrix membrane |
| Inhibitor Removal Buffer | BioTeke | B010006022 | Removal of Inhibitors in DNA Extraction |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 | Precipitate or isolate DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
| Proteinase K | BioTeke | B010006022 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | real-time fluorescence quantification PCR |
| Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
| Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
| Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Remove impurities such as cell metabolites |
References
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
- Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
- Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
- Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
- Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
- Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
- Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
- Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
- Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
- Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
- Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
- Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
- Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
- Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
- Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world’s ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
- Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
- Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
- Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
- Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
- Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
- Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
- Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
- Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
- Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
- Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
- Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
- Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
- Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
- Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).
