Her præsenteres en protokol, hvor flere bioinformatiske værktøjer kombineres for at studere de biologiske funktioner af TMEM200A i kræft. Derudover validerer vi også eksperimentelt bioinformatikforudsigelserne.
Transmembranproteinet, TMEM200A, er kendt for at være forbundet med humane kræftformer og immuninfiltration. Her vurderede vi funktionen af TMEM200A i almindelige kræftformer ved multiomics-analyse og brugte in vitro-cellekulturer af maveceller til at verificere resultaterne. Ekspressionen af TMEM200A i flere humane kræfttyper blev vurderet ved hjælp af RNA-seq-data fra UCSC Xena-databasen. Bioinformatisk analyse afslørede en potentiel rolle TMEM200A som en diagnostisk og prognostisk biomarkør.
Kulturer af normale mave- og kræftcellelinjer blev dyrket, og TMEM200A blev slået ned. Ekspressionsniveauerne for TMEM200A blev målt ved anvendelse af kvantitativ realtidspolymerasekædereaktion og western blotting. In vitro tab-af-funktion undersøgelser blev derefter anvendt til at bestemme rollerne af TMEM200A i den ondartede adfærd og tumordannelse af gastrisk cancer (GC) celler. Western blots blev brugt til at vurdere effekten af knockdown på epitel-mesenkymal overgang (EMT) og PI3K / AKT signalvej i GC. Bioinformatisk analyse viste, at TMEM200A blev udtrykt på høje niveauer i GC.
Spredningen af GC-celler blev hæmmet af TMEM200A knockdown, som også reducerede vimentin-, N-cadherin- og Snai-proteiner og hæmmede AKT-phosphorylering. PI3K/AKT signalvejen syntes også at være involveret i TMEM200A-medieret regulering af GC-udvikling. Resultaterne præsenteret her tyder på, at TMEM200A regulerer tumormikromiljøet ved at påvirke EMT. TMEM200A kan også påvirke EMT gennem PI3K / AKT signalering, hvilket påvirker tumormikromiljøet. Derfor kan TMEM200A i pan-cancers, især GC, være en potentiel biomarkør og onkogen.
Kræft har vist sig at være et vedvarende folkesundhedsproblem, der bringer menneskers sundhed i fare globalt1på grund af dets høje sygelighed og dødelighed på verdensplan, hvilket udgør en tung økonomisk og medicinsk byrde for samfundet2. Betydelige fremskridt inden for kræftbehandling er opnået i de senere år takket være opdagelsen af kræftmarkører3, og forskere har udviklet nye diagnostiske metoder og nye lægemidler til behandling af kræft. Nogle patienter med kræft har dog stadig dårlige prognoser på grund af faktorer som medicinresistens, bivirkninger af lægemidler og kemisk følsomhed4. Der er derfor et presserende behov for at identificere nye biomarkører til screening og behandling af kræft i tidlige stadier5.
Membranproteiner er proteiner, der kan binde og integrere i celler og organelmembraner6. Disse kan grupperes i tre kategorier afhængigt af styrken af binding til membranen og deres placering: lipidforankrede proteiner, integrerede proteiner og perifere membranproteiner 7,8. Et transmembranprotein (TMEM) er et integreret membranprotein, der består af mindst et transmembransegment9, som passerer enten helt eller delvist gennem den biologiske membran.
Selvom virkningsmekanismerne for proteiner, der tilhører TMEM-familien, ikke forstås godt, er disse proteiner kendt for at være involveret i flere typer kræftformer10. Flere TMEM-proteiner er forbundet med migrerende, proliferative og invasive fænotyper, og deres udtryk er ofte forbundet med en patients prognose11. Derfor er TMEM-familiemedlemmer blevet målet for forskning. En omfattende gennemgang af eksisterende rapporter om TMEM afslørede, at de for det meste er forbundet med inter- og intracellulær signalering12, immunrelaterede sygdomme og tumorigenese10. Mange TMEM’er har også vigtige fysiologiske funktioner, for eksempel ionkanaler i plasmamembranen, aktivering af signaltransduktionsveje samt formidling af cellekemotaxis, vedhæftning, apoptose og autofagi10. Derfor antog vi, at TMEM-proteiner kan være vigtige prognostiske markører i påvisning og behandling af tumorer.
TMEM200A ekspression er signifikant forhøjet i gastrisk cancer (GC). Højere ekspression af TMEM200A13, som har otte exoner og en fuld længde på 77.536 kb på kromosom 6q23.1, har været forbundet med en dårlig prognose for samlet overlevelse (OS) i tilfælde af GC. Alligevel er ændringerne i dets udtryk sjældent blevet rapporteret i onkologiske undersøgelser. Denne artikel sammenligner og analyserer nytten af TMEM200A som terapeutisk mål og tumordiagnostisk markør i forskellige kræftundersøgelser ved hjælp af forskellige offentligt tilgængelige datasæt. Vi vurderede effektiviteten af TMEM200A som en pan-cancer diagnostisk og prognostisk biomarkør samt dens ekspressionsniveauer i forskellige humane kræfttyper ved hjælp af RNA-seq-data fra UCSC Xena- og TCGA-databaserne samt ved kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (qRT-PCR) og western blotting.
Effekten af TMEM200A ekspressionsniveauer på mutationshastigheder, regulatoriske processer, tumordiagnose og prognose, immuninfiltration og immunterapi blev yderligere undersøgt ved hjælp af en blanding af beregningsværktøjer og datasætwebsteder. CBioPortal og Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) databaser blev brugt til at undersøge mutationer i TMEM200A. Sangerbox- og TISIDB-websteder blev brugt til at forstå, hvordan TMEM200A påvirker immuninfiltration. Onlineværktøjet Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) og CancerSEA-databasen blev brugt til at undersøge funktionen af TMEM200A. Endelig, for at vurdere virkningen af TMEM200A på GC-cellernes ondartede adfærd og tumorudviklingsfunktion, blev der udført et funktionstabseksperiment i et in vitro-assay . Derudover blev western blotting udført for at vurdere, hvordan knockdown TMEM200A påvirket PI3K / AKT signalvejen og epitel-mesenkymal overgang (EMT) i GC.
TMEM200A tilhører en familie af TMEM’er, der er afgørende for, at kræftceller kan sprede sig38. Det variable udtryk for TMEM200A i forskellige maligniteter har fået mindre opmærksomhed, og der mangler en grundig pancancerundersøgelse. Imidlertid fortsætter beviser med at akkumulere, hvilket viser, at TMEM-transmembranproteinfamilien kan være vigtig for at holde kræftceller ondartede gennem interaktioner med flere proteiner, for eksempel fremmer aktivering af TMEM16A Ca<s…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82160550).
Anti-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 60203-2-Ig | |
Anti-E-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 20874-1-AP | |
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody | Proteintech Group, Inc | 10494-1-AP | |
Anti-N-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 22018-1-AP | |
Anti-P-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
Anti-snail antibody | Proteintech Group, Inc | 13099-1-AP | |
Anti-Vimentin antibody | Proteintech Group, Inc | 10366-1-AP | |
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit |
Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd | UEL-UE-MN-MS-RNA-50G | |
BCA Protein Assay Kit | Epizyme Biotech | ZJ101L | |
CCK-8 reagent | MedChemExpress | HY-K0301-500T | |
Fetal bovine serum (FBS) | CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC | FBSSR-01021 | |
GAPDH primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG |
|
HighGene plus Transfection reagent | ABclonal | RM09014P | |
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-2 | |
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells | Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd. | ||
Human STAD HGC-27 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
Human STAD SGC-7901 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MQ10101S | |
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MR05101M | |
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit | Epizyme Biotech | SQ201 | |
PAGE Gel Fast Preparationb Kit | Epizyme Biotech | PG111 | |
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | P1400-100 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck KGaA | IPVH00010-1 | |
Protein Free Rapid Blocking Buffer | Epizyme Biotech | PS108P | |
RIPA lysis solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | R0010 | |
RPMI 1640 complete medium | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
Skimmed milk | Campina: Elk | ||
TBST buffer solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | T1082 | |
The protein loading buffer | Epizyme Biotech | LT101S | |
TMEM200A knockdown plasmid | MiaoLing Plasmid | ||
TMEM200A primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT | |
TMEM200A SiRNA1 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC | |
TMEM200A SiRNA2 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC | |
TMEM200A SiRNA3 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC | |
Transmembrane protein 200A Antibody | Proteintech Group, Inc | 48081-1 | |
Equipment | |||
CO2 cell culture incubator | Haier Group | PYXE-80IR | |
Electrophoresis instrument | Bio-RAD | ||
Fluorescence quantitative PCR instrument | Bio-RAD | ||
Gel Imaging System (Tanon 5200) | Tanon Science & Technology Co., Ltd | LAB-0002-0007-SHTN | |
Multifunctional Enzyme Labeler | Berthold |