Pankreatik Duktal Adenokarsinomun Pluripotentliğe Yeniden Programlanması
Summary
Mevcut protokol, Pankreatik Duktal Adenokarsinom (PDAC) ve normal pankreatik duktal epitel hücrelerinin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC’ler) yeniden programlanmasını açıklamaktadır. Lentivirüsün hazırlanmasından stabil iPSC hatlarının oluşturulmasına kadar optimize edilmiş ve ayrıntılı, adım adım bir prosedür sunuyoruz.
Abstract
Transkripsiyon faktörleri kullanılarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC’ler) üretimi, hemen hemen tüm farklılaşmış hücre tiplerinden elde edilmiştir ve araştırma ve klinik uygulamalar için oldukça değerli olduğu kanıtlanmıştır. İlginç bir şekilde, pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC) gibi kanser hücrelerinin iPSC yeniden programlanmasının invaziv PDAC fenotipini geri döndürdüğü ve kanser epigenomunu geçersiz kıldığı gösterilmiştir. PDAC kaynaklı iPSC’lerin farklılaşması, PDAC ilerlemesini erken pankreatik intraepitelyal neoplazi (PanIN) öncüsünden özetleyebilir ve PDAC ilerlemesi sırasında erken meydana gelen moleküler ve hücresel değişiklikleri ortaya çıkarabilir. Bu nedenle, PDAC’den türetilen iPSC’ler, erken tespit tanı belirteçlerinin keşfi için PDAC’nin en erken aşamalarını modellemek için kullanılabilir. Bu, daha erken PanIN evreleri için güvenilir biyobelirteçlerin bulunmaması nedeniyle tipik olarak geç metastatik evrelerde teşhis edilen PDAC hastaları için özellikle önemlidir. Bununla birlikte, PDAC da dahil olmak üzere kanser hücre hatlarının pluripotentliğe yeniden programlanması zorlu, emek yoğun ve farklı hatlar arasında oldukça değişken olmaya devam etmektedir. Burada, bisiztronik lentiviral vektörleri kullanarak çeşitli insan PDAC hücre hatlarından iPSC’ler üretmek için daha tutarlı bir protokol açıklıyoruz. Ortaya çıkan iPSC çizgileri stabildir ve yeniden programlama faktörlerinin veya indüklenebilir ilaçların eksojen ekspresyonuna bağımlılık göstermez. Genel olarak, bu protokol, daha spesifik ve PDAC vakalarını temsil eden erken biyobelirteçleri keşfetmek için gerekli olan çok çeşitli PDAC’den türetilmiş iPSC’lerin oluşturulmasını kolaylaştırır.
Introduction
Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAK) en ölümcül malignitelerden biridir ve hastalığın asemptomatik olması nedeniyle erken tanı zor olmaya devam etmektedir. PDAC hastalarının çoğu, çok sınırlı tedavi seçeneklerinin mevcut olduğu ileri metastatik evrede teşhis edilir 1,2. Bunun başlıca nedeni, kan dolaşımına salınan proteinler olarak kolayca tespit edilebilenler gibi daha önceki aşamalar için güvenilir biyobelirteçlerin olmamasıdır.
PDAC, ilerlemesi sırasında çok erken yayılabilir ve PDAC pankreasta lokalize olduğunda erken kanser tespiti ile daha iyi bir prognoz ilişkilendirilmiştir3. Bununla birlikte, PDAC hastalarının onda birinden daha azına cerrahi rezeksiyona izin veren olumlu bir prognoz teşhisi konmaktadır. Bununla birlikte, rezektabl tümörleri olan birkaç kişi de 12 ay içinde tümör nüksüne eğilimlidir4.
Son elli yılda, cerrahi tekniklerde, hasta bakımında ve tedavi yöntemlerinde dikkate değer gelişmeler kaydedilmiştir 5,6. Bununla birlikte, cerrahi olarak rezeke edilen PDAC hastalarında 5 yıllık sağkalım oranı ancak %17’ye yükselmiştir. Bununla birlikte, bu, neredeyse hiç değişmeden kalan (%0,9) rezeke edilmemiş hastalardan daha iyidir4,7. Kemoterapi diğer tek alternatif PDAC tedavisidir. Yine de, PDAC hastalarının büyük çoğunluğu Gemsitabin 7,8 gibi kemoterapi ilaçlarına karşı güçlü direnç gösterdiğinden bu seçenek çok sınırlıdır. Erlotinib gibi diğer ilaçlar, çoğu Erlotinib direnci9 gösteren spesifik mutasyonlara sahip küçük bir grup PDAC hastası için mevcuttur. Çoğu PDAC hastasında kemoterapi ile ilişkili olumsuz yan etkiler, bu tedavinin bir başka dezavantajıdır10. Son zamanlarda, umut verici stratejiler, immün kontrol noktası inhibitörlerinin (ICI’ler) ve küçük moleküllü kinaz inhibitörlerinin (SMKI’ler) PDAC tedavisinde etkili olabileceğini göstermiştir, ancak bu hedefe yönelik tedavilere kalıcı yanıtlar hastaların azınlığı ile sınırlı kalmaktadır11,12. Genel olarak, PDAC’a özgü erken biyobelirteçlerin keşfi, erken tanı ve tedavi için yeni yollar açabilir.
PDAC, non-invaziv pankreas kanalı epitel proliferasyonlarından kaynaklanan pankreas intraepitelyal neoplazmlarından (PanIN) öncü lezyonlarındangelişir 13,14. PanIN oluşumu KRAS gibi onkogen mutasyonları ile başlatılırken, PDAC’a ilerleme için ek genetik ve epigenetik değişiklikler gereklidir. PanIN’in farklı aşamalardan invaziv PDAC’a ilerlemesinin yaklaşık 10 yıl sürdüğü öngörülmüştür 13,15,16,17. Bu zaman dilimi, erken PDAC tanısından yararlanmak için harika bir fırsat sağlar. Bu nedenle, PDAC ilerlemesini incelemek için tümör ksenogreft hayvan modelleri ve organoid kültürleri oluşturmak için kapsamlı araştırmalar yapılmıştır 18,19,20,21. Bu modeller, erken PanIN fazlarından geçiş olmasa da, PDAC’nin invaziv aşamalarını incelemek için çok yararlı olmuştur. Bu nedenle, erken tespit biyobelirteçlerinin keşfedilmesini sağlamak için PanIN aşamalarının erken ilerlemesini özetleyebilecek deneysel modeller geliştirmek önemlidir.
Dört transkripsiyon faktörü OCT4, SOX2, KLF4 ve c-MYC (OSKM) kullanılarak somatik hücrelerin indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC’ler) yeniden programlanması, hücresel plastisiteninkapsamını göstermiştir 22. Kanser hücresi plastisitesi iyi belgelenmiştir ve insan kanser hücrelerini iPSC’lere yeniden programlamak, hücreleri orijinal hücresel durumlarına sıfırlamak için başarıyla kullanılmış ve kanserin ilerlemesi sırasında biriken epigenetik hakaretlerin çoğunu ortadan kaldırmıştır 23,24,25,26,27,28,29. Bu nedenle, kanser hücresi kimliğini manipüle etmek için bu yeniden programlama stratejisini kullanma olasılığı, kanser tedavisinde büyük umut vaat etmiştir30,31. Aslında, PDAC’lerden türetilen iPSC’lerin farklılaşmasının, erken PanIN aşamaları32 boyunca PDAC ilerlemesini özetleyebileceğini daha önce göstermiştik. PDAC’ın erken-orta evrelerine özgü genleri ve yolakları tanımlayarak, erken PDAC tanısı için klinik olarak kullanılabilecek aday biyobelirteçler tanımlanmıştır32,33. Bununla birlikte, tek bir iPSC hattı kullanılarak keşfedilen biyobelirteçler, PDAC hastalarının çoğunda sınırlı kapsama alanı göstermiştir32. Diğer PDAC hastalarından iPSC hatları üretmenin zorlukları, daha güvenilir biyobelirteçler keşfetme yeteneğini durdurmuştur. Bu, OSKM iletiminin heterojenliği de dahil olmak üzere birçok teknik faktörden kaynaklanmaktadır, çünkü insan birincil PDAC hücrelerinin yalnızca küçük bir kısmı dört faktörün tümünü içeriyordu ve yeniden programlamaya başarılı bir şekilde yanıt verdi. Burada, OSKM’nin daha verimli ve tutarlı bir çift lentiviral iletimi kullanılarak birincil PDAC hücrelerinin yeniden programlanması için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kanserin ilerlemesini incelemek için iPSC yeniden programlamasının kullanımını kolaylaştırmak için, pankreas kanseri hücrelerini yeniden programlamak için sağlam bir protokol oluşturulmuştur. Kanser hücrelerini pluripotentliğe yeniden programlamanın şimdiye kadar çok zor olduğu kanıtlanmıştır, çünkü sadece birkaç çalışma kanser hücrelerinden iPSC’leri başarıyla üretmiştir 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 <sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S ve J.K, Cancer Research UK ve OHSU’ya finansman için teşekkür eder (CRUK-OHSU Proje Ödülü C65925/A26986). ve Tic. A.Ş., MRC kariyer geliştirme ödülü (MR/N024028/1) ile desteklenmektedir. A.A. Kral Abdülaziz Bilim ve Teknoloji Şehri’nden doktora bursu (Burs ref. 1078107040) ile finanse edilmektedir. J.K, MRF Yeni Araştırmacı Hibesi (GCNCR1042A) ve Knight CEDAR hibesi (68182-933-000, 68182-939-000) tarafından finanse edilmektedir. pSIN4-EF1a-O2S ve pSIN4-CMV-K2M yeniden programlama vektörünü sağladığı için Prof Keisuke Kaji’ye teşekkür ederiz. Açık erişim amacıyla, yazar, bu gönderimden kaynaklanan herhangi bir Yazar Kabul Edilen Makale sürümüne bir Creative Commons Atıf (CC BY) lisansı uygulamıştır.
Materials
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |
| pMDG | AddGene | 187440 |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 |
| psPAX2 | AddGene | 12260 |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
References
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. 암 연구학. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Hu, J. X., et al. Pancreatic cancer: A review of epidemiology, trend, and risk factors. World Journal of Gastroenterology. 27 (27), 4298 (2021).
- Howlader, N., et al. SEER cancer statistics review, 1975-2013. National Cancer Institute. 19, (2016).
- Bengtsson, A., Andersson, R., Ansari, D. The actual 5-year survivors of pancreatic ductal adenocarcinoma based on real-world data. Scientific Reports. 10 (1), 16425 (2020).
- He, J., et al. 2564 resected periampullary adenocarcinomas at a single institution: trends over three decades. HPB. 16 (1), 83-90 (2014).
- Dusch, N., et al. Factors predicting long-term survival following pancreatic resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas: 40 years of experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 18 (4), 674-681 (2014).
- Principe, D. R., et al. The current treatment paradigm for pancreatic ductal adenocarcinoma and barriers to therapeutic efficacy. Frontiers in Oncology. 11, 688377 (2021).
- Papademetrio, D. L., et al. Interplay between autophagy and apoptosis in pancreatic tumors in response to gemcitabine. Targeted Oncology. 9 (2), 123-134 (2014).
- Ng, S. S., Tsao, M. S., Nicklee, T., Hedley, D. W. Effects of the epidermal growth factor receptor inhibitor OSI-774, Tarceva, on downstream signaling pathways and apoptosis in human pancreatic adenocarcinoma 1 supported by the National Cancer Institute of Canada and the Pat Myhal Fund for Pancreatic Cancer Research. Molecular Cancer Therapeutics. 1 (10), 777-783 (2002).
- Sultana, A., et al. Meta-analyses of chemotherapy for locally advanced and metastatic pancreatic cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (18), 2607-2615 (2007).
- Sun, J., Russell, C. C., Scarlett, C. J., McCluskey, A. Small molecule inhibitors in pancreatic cancer. RSC Medicinal Chemistry. 11 (2), 164-183 (2020).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Hruban, R. H., et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. The American Journal of Surgical Pathology. 25 (5), 579-586 (2001).
- Maitra, A., Hruban, R. H. Pancreatic cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 157-188 (2008).
- Vincent, A., Herman, J., Schulick, R., Hruban, R. H., Goggins, M. Pancreatic cancer. The Lancet. 378 (9791), 607-620 (2011).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Lennon, A. M., et al. The early detection of pancreatic cancer: what will it take to diagnose and treat curable pancreatic neoplasia. 암 연구학. 74 (13), 3381-3389 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. 암 연구학. 67 (3), 1030-1037 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Suvà, M. L., et al. Reconstructing and reprogramming the tumor-propagating potential of glioblastoma stem-like cells. Cell. 157, 580-594 (2014).
- Kotini, A. G., et al. Stage-specific human induced pluripotent stem cells map the progression of myeloid transformation to transplantable leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Stricker, S. H., et al. Widespread resetting of DNA methylation in glioblastoma-initiating cells suppresses malignant cellular behavior in a lineage-dependent manner. Genes Development. 27 (6), 654-669 (2013).
- Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
- Aparicio, L. A., et al. Clinical implications of epithelial cell plasticity in cancer progression. Cancer letters. 366 (1), 1-10 (2015).
- Grimont, A., Leach, S. D., Chandwani, R. Uncertain beginnings: acinar and ductal cell plasticity in the development of pancreatic cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (2), 369-382 (2022).
- Greenspan, L. J., Weinstein, B. M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 24 (2), 251-269 (2021).
- Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
- Zhang, X., Cruz, F. D., Terry, M., Remotti, F., Matushansky, I. Terminal differentiation and loss of tumorigenicity of human cancers via pluripotency-based reprogramming. Oncogene. 32 (18), 2249-2260 (2013).
- Kim, J., et al. An iPSC line from human pancreatic ductal adenocarcinoma undergoes early to invasive stages of pancreatic cancer progression. Cell Reports. 3 (6), 2088-2099 (2013).
- Kim, J., et al. Detection of early pancreatic ductal adenocarcinoma with thrombospondin-2 and CA19-9 blood markers. Science Translational Medicine. 9 (398), (2017).
- Susac, L., et al. Structure of a fully assembled tumor-specific T cell receptor ligated by pMHC. Cell. 185 (17), 3201-3213 (2022).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Carette, J. E., et al. Generation of iPSCs from cultured human malignant cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 115 (20), 4039-4042 (2010).
- Choi, S. M., et al. Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 118 (7), 1801-1805 (2011).
- Hochedlinger, K., et al. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes & Development. 18 (15), 1875-1885 (2004).
- Hu, K., et al. Efficient generation of transgene-free induced pluripotent stem cells from normal and neoplastic bone marrow and cord blood mononuclear cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 117 (14), e109-e119 (2011).
- Iskender, B., Izgi, K., Canatan, H. Reprogramming bladder cancer cells for studying cancer initiation and progression. Tumor Biology. 37, 13237-13245 (2016).
- Khoshchehreh, R., et al. Epigenetic reprogramming of primary pancreatic cancer cells counteracts their in vivo tumourigenicity. Oncogene. 38 (34), 6226-6239 (2019).
- Kim, H. J., et al. Establishment of hepatocellular cancer induced pluripotent stem cells using a reprogramming technique. Gut and Liver. 11 (2), 261 (2017).
- Lin, S. L., et al. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA. 14 (10), 2115-2124 (2008).
- Miyoshi, N., et al. Defined factors induce reprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 40-45 (2010).
- Singovski, G., et al. In vivo epigenetic reprogramming of primary human colon cancer cells enhances metastases. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 157-173 (2016).
- Zhao, H., et al. A highly optimized protocol for reprogramming cancer cells to pluripotency using nonviral plasmid vectors. Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells". 17 (1), 7-18 (2015).
- Lo, C. A., et al. Quantification of protein levels in single living cells). Cell Reports. 13 (11), 2634-2644 (2015).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Prösch, S., et al. Inactivation of the very strong HCMV immediate early promoter by DNA CpG methylation in vitro. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 377 (3), 195-201 (1996).
- Mehta, A. K., Majumdar, S. S., Alam, P., Gulati, N., Brahmachari, V. Epigenetic regulation of cytomegalovirus major immediate-early promoter activity in transgenic mice. Gene. 428 (1-2), 20-24 (2009).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Chronis, C., et al. Cooperative binding of transcription factors orchestrates reprogramming. Cell. 168 (3), 442-459 (2017).
- Li, D., et al. Chromatin accessibility dynamics during iPSC reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (6), 819-833 (2017).
- Soufi, A., Donahue, G., Zaret, K. S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors’ initial engagement with the genome. Cell. 151 (5), 994-1004 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
