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방법 논문

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

2.5K 조회수

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DOI:

10.3791/65825

⸱

2023년 10월 13일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Institute of Neuroscience, Key Laboratory of Neurogenetics and Channelopathies of Guangdong Province and the Ministry of Education of China, the Second Affiliated Hospital, Guangzhou Medical University, 2The Second Clinical Medicine School of Guangzhou Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Medicine, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 4Key Laboratory for Reproductive Medicine of Guangdong Province, The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

이 논문에서

요약

여기에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생체 외 칼슘 이미징을 통해 성인 초파리의 ictal 사건을 조사하는 데 유용한 도구를 제공하여 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐구할 수 있도록 합니다.

초록

간질은 재발성 발작을 특징으로 하는 신경 장애로, 유전적 기원과 부분적으로 관련이 있으며 전 세계적으로 7천만 명 이상의 개인에게 영향을 미칩니다. 간질의 임상적 중요성에도 불구하고 중추 신경계의 신경 활동에 대한 기능적 분석은 여전히 개발되어야 합니다. GCaMP6와 같은 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표의 안정적인 발현과 함께 이미징 기술의 최근 발전은 뇌 전체 및 단일 세포 해상도 수준 모두에서 간질 연구에 혁명을 일으켰습니다. Drosophila melanogaster는 정교한 분자 유전학 및 행동 분석으로 인해 간질의 기저에 있는 분자 및 세포 메커니즘을 조사하기 위한 도구로 등장했습니다. 이 연구에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징을 위한 새롭고 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 뇌 전체는 잘 알려진 간질 유전자인 cac로 준비되며, 강타 민감성 발작 유사 행동 분석의 후속 조치로 신경 활동을 식별하기 위해 컨포칼 현미경으로 칼슘 이미징을 위해 녹다운 파리를 만듭니다. cac 넉다운 파리는 야생형 파리보다 더 큰 스파이크와 더 적은 작은 스파이크를 포함하여 발작과 유사한 행동과 비정상적인 칼슘 활동의 비율이 더 높았습니다. 칼슘 활동은 발작과 유사한 행동과 상관관계가 있었다. 이 방법론은 간질에 대한 병원성 유전자를 스크리닝하고 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐색하는 데 효율적인 방법론 역할을 합니다.

서론

간질은 자발적이고 이유 없는 발작과 비정상적인 신경 네트워크 활동의 재발을 특징으로 하는 복잡한 만성 신경 장애로, 전 세계적으로 7천만 명 이상의 개인에게 영향을 미치며 가장 흔한 신경 질환중 하나이며1 가족과 사회에 큰 부담을 줍니다. 뇌전증의 영향을 고려하여 발작의 원인을 규명하기 위한 많은 연구가 수행되었으며, 그 중 유전학은 많은 유형의 간질 또는 간질 증후군의 주요 원인으로 승인되었다2. 지난 수십 년 동안 게놈 기술의 발전으로 인해 이온 채널 및 비이온 채널 유전자를 포함하여 발작 발생에 중요한 역할을 하는 새로운 간질 관련 유전자의 발견이 급격히 증가했습니다 3,4. 그러나 유전자와 간질 표현형 사이의 근본적인 메커니즘과 기능 분석은 완전히 이해되지 않았습니다. 뇌전증 관련 유전자 및 기전을 규명하는 것은 환자를 효율적으로 관리할 수 있는 가능성을 제공한다 5,6.

세포질 칼슘 신호는 신경 활동과 시냅스 전달의 중추적인 요소입니다. 뇌 절편(brain slices)7, 생체 내(in vivo)8,9 및 생체내 e-x vivo(10)를 포함하는 칼슘 이미징(calcium imaging)은 1970년대 이래로 신경 세포 흥분성의 표지자로서 신경 활동(neuronal activity)11을 모니터링하기 위해 이용되어 왔다12,13. GCaMP6와 같은 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(GECI)와 결합된 이미징 기술의 최근 발전은 높은 수준의 시공간 정밀도를 가진 뇌 전체 및 단일 세포 해상도 수준 14,15,16 모두에서 간질 연구에 혁명을 일으켰습니다. 칼슘 농도와 과도현상의 변화는 활동 전위와 시냅스 전달에서 각각 관찰되었으며,14 이는 세포 내 칼슘 수준의 변화가 뉴런의 전기적 흥분성과 엄격한 상관 관계를 나타낸다는 것을 나타낸다17,18. 칼슘 영상은 또한 발달 발작 모델(developmental seizure model)9로 적용되었으며, 항경련 화합물(anticonvulsive compounds)을 스크리닝하기 위해 초파리(Drosophila)에서 수행되었다19.

Drosophila melanogaster는 정교한 분자 유전학 및 행동 분석20,21,22로 간질과 같은 과학 연구에서 강력한 모델 유기체로 부상하고 있습니다. 또한, 초파리의 고급 유전 도구는 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표 GCaMP6의 발현에 기여했습니다. 예를 들어, Gal4 및 UAS 기반 바이너리 전사 시스템은 공간적, 시간적으로 제어되는 방식으로 GCaMP6의 특정 발현을 가능하게 합니다. 초파리는 아주 작은 유기체이기 때문에, 생체 내 칼슘 이미징은 외과적 개입을 수행하기 위해 능숙한 수술 기술을 필요로 하는데, 이 수술에서는 뇌의 등쪽의 작은 부분만이 작은 창을 통해 노출되었다14,23. 동시에 초파리의 온전한 뇌에서 생체 외 칼슘 이미징을 사용하여 전체 뇌의 관심 영역(ROI)을 모니터링할 수 있습니다.

이 연구에서는 간질 활동을 모니터링하기 위해 GCaMP6 발현 성인 초파리의 생체 외 칼슘 이미징을 제시합니다. CACNA1A 잘 알려진 간질 유전자이며, cac는 CACNA1A에 대한 상동체인 Cav2 채널에 속합니다. 우리는 cac 넉다운 파리 tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi의 뇌를 해부하고 xyt 스캐닝 모드의 컨포칼 현미경을 사용하여 이미징하는 것으로 시작했습니다. 그런 다음 %ΔF/F 값 및 GCaMP6 형광의 칼슘 이벤트와 같은 자발적 발작 유사 이벤트를 정량화하는 지표를 계산하여 ROI의 칼슘 신호 변화를 분석했습니다. 또한 칼슘 이미징 결과를 검증하기 위해 cac-knockdown 파리에 대한 발작 행동 테스트를 유도하기 위해 vortex machine에 의한 기계적 자극을 수행했습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 체외 칼슘 이미징을 통해 성인 초파리의 ictal 사건을 조사하는 데 유용한 도구를 제공하여 세포 수준에서 간질의 잠재적 메커니즘을 탐색할 수 있도록 합니다.

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프로토콜

1. Bang-sensitive 분석을 위한 프로토콜

  1. Gal4/UAS 시스템(21)을 통해 tub-Gal4 드라이버 라인과 UAS-cac-RNAi 라인을 교차하여 실험용 파리를 설정합니다. tub-Gal4 라인의 처녀 파리와 UAS-cac-RNAi 라인의 수컷 파리를 수집합니다. 그런 다음 처녀 파리와 수컷 파리를 같은 유리병에 옮겨 새끼를 수확합니다.
    참고: tub-Gal4 드라이버 라인을 사용하면 cac 유전자의 전역 knockdown을 달성할 수 있습니다. UAS-cac-RNAi 라인을 대조군으로 사용합니다.
  2. 3-5일 동안 폐색한 후 100%CO2 (CO2 마취 장비)를 사용하여 파리를 부드럽게 마취하고 브러시로 tub-Gal4>UAS-cac-RNAi 파리와 UAS-cac-RNAi 파리를 모두 수집합니다. 이 파리는 테스트 1일 전에 깨끗하고 새 식품 바이알로 옮겨 잘 준비되었는지 확인합니다.
  3. CO2를 사용하여 파리를 부드럽게 마취합니다. 마취가 끝나면 4-6 마리의 파리를 각각의 신선한 바이알에 조심스럽게 넣습니다. 테스트를 진행하기 전에 파리가 약 1시간 동안 마취에서 회복되도록 합니다.
    참고: 각 유전자형에 대해 최소 5건의 임상시험이 진행되었으며, 각 임상시험은 6개의 파리 바이알로 구성되었습니다.
  4. 녹음 장비를 설정합니다. 화이트보드 앞 삼각대에 카메라(720-1080P, 최소 30-60FPS, AF 고정)를 배치합니다. 빈 바이알을 사용하여 카메라의 초점을 수동으로 조정하여 선명하고 정확한 영상을 보장합니다.
  5. 소용돌이 믹서를 사용하여 기계적으로 유도된 발작과 같은 동작을 수행합니다. 4-6개의 파리가 들어 있는 각 바이알을 소용돌이 믹서에 놓고 가장 높은 설정(2800rpm)에서 정확히 10초 동안 실행합니다. 소용돌이가 끝나면 즉시 바이알을 화이트보드에 놓습니다.
  6. 파리를 관찰하고 파리가 보이는 발작과 유사한 행동을 기록하십시오.
    참고: 파리에서 관찰되는 발작과 유사한 행동은 발작(진동하는 날개로 나타남), 마비, 회복의 세 단계로 구성된다24. 발작 파리와 실험된 파리의 비율은 발작률로 정의되었습니다.
    1. 파리가 똑바로 설 수 있는 능력을 회복할 때까지 와류 후 필요한 시간으로 회복 시간을 측정합니다25.

2. 생체 외 뇌의 칼슘 이미징을 위한 프로토콜

  1. tub-Gal4>UAS-GCaMP6m 및 tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi 라인 플라이를 각각 설정합니다. 생체외 뇌에서 칼슘 활성을 모니터링할 수 있도록 Gal4/UAS 이진 발현 시스템(21)을 사용하여 파리를 생성한다.
  2. 제공된 레시피(표 1)26에 설명된 대로 해부 용액을 준비합니다.
    1. 표 1에 설명된 대로 외부 솔루션을 준비합니다. NaOH로 pH 7.2로 조정하고 삼투압을 250-255mOsm/L로 조정합니다.
      알림: 외부 용액은 4°C에서 1주일 동안 보관할 수 있습니다.
    2. 해부 용액을 준비하기 위해 외부 용액 600μL에 파파인 현탁액 9단위와 L-라이신(2mg/mL)을 추가합니다. 용액을 소용돌이치고 용액이 맑아질 때까지 15분 동안 기다립니다.
      알림: 해부 용액은 4시간 이내에 사용하는 것이 좋습니다.
  3. 사용하기 전에 외부 용액에 산소화 식염수(95% 산소 및 5% 이산화탄소)를 5분 동안 관류하십시오. 피펫을 사용하여 약 10μL의 해부 용액을 페트리 접시로 옮깁니다. 이 솔루션은 뇌 해부 및 영상에 필요한 조건을 제공합니다.
  4. 주사기 바늘과 현미경을 사용하여 tub-Gal4>UAS-GCaMP6m 및 tub-Gal4>UAS-GCaMP6m/cac-RNAi 라인의 뇌를 조심스럽게 해부합니다. 뇌 해부에 대해 확립된 프로토콜을 따르십시오27.
  5. 피펫을 사용하여 준비된 뇌를 5mL의 신선한 외부 용액이 들어 있는 기록 접시에 옮기고 회복을 위해 기록 접시에 C-sharp 홀더를 사용하여 뇌를 3-5분 동안 고정합니다.
    알림: C-sharp 홀더는 7mm 간격의 평행 섬유가 교차하는 직경 0.5mm의 금속 반원으로 만들어졌습니다.
  6. 공초점 이미징 설정 및 획득
    1. 컨포칼 이미징의 경우 20x 대물렌즈와 xyt 스캐닝 모드로 각 뇌를 캡처합니다. 20x 광학 증폭을 기반으로 한 추가 4.5x 디지털 증폭으로 버섯 몸체 뉴런을 식별합니다.
      참고: 각 생체 외 뇌는 1시간 이상 이미징할 수 있습니다.
    2. 16μw 레이저 출력으로 488nm 레이저 여기(excitation)에서 전체 뇌-GCaMP6m 방출을 획득합니다. 스캔 매개변수를 400 픽셀 x 256 픽셀의 픽셀 크기로 설정합니다. 5.3Hz 획득 속도를 사용하고 3분 동안 녹음합니다.
  7. 모든 뇌에서 5-8개의 ROI를 식별하고 형광을 분석합니다. 버섯 몸체 뉴런의 세포체를 관심 영역으로 수동으로 결정28.
    1. 식별된 뉴런에 레이블을 지정하고 ImageJ로 형광 강도를 측정합니다. %ΔF/F = (F1-F0)/(F0-B)를 통해 GCaMP6m의 형광 데이터를 분석합니다. 기준선에서 2 - 2.5 표준 편차 증가하는 세포 내 형광을 작은 스파이크로 정의하고, 기준선보다 2.5 표준 편차 이상 증가하는 세포 내 형광을 큰 스파이크로 정의합니다. 스튜던트 t-검정으로 칼슘 급증 빈도를 분석합니다.
      참고: F0은 ROI의 초기 5개 프레임의 평균 형광 강도에 의한 기준선으로, F1은 주어진 시점의 형광 강도로, B는 형광이 없는 배경으로 정의되었습니다. 뉴런의 시간적 생리적 활동도 노이즈 신호와 구별하는 데 도움이 됩니다.

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결과

이 프로토콜을 사용하여 cac 넉다운 파리가 WT 파리보다 발작 유사 행동의 비율이 훨씬 더 높다는 것을 발견했습니다(17.00 ± 2.99 [n = 6] 대 4.50 ± 2.03 [n = 6]; 피 = 0.0061; 스튜던트 t-검정, 그림 1A). 대부분의 tub-Gal4>UAS-cac-RNAi 파리는 1-5초 이내에 회복된 반면, UAS-cac-RNAi 파리는 2초 이내에 회복되었습니다. 1초 이내에 cac 넉다운 파리의 회수율은 WT 파리보다 현저히 낮았다(88.08 ± 1.89 [n = 6] 대 96.50 ± 1.82 [n = 6]; 피 = 0.0093; 스튜던트 t-검정, 그림 1B). 그림 2에...

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토론

칼슘 이온은 화학적 및 전기적 섭동에 대한 다양한 생리학적 및 병태생리학적 반응에서 중추적인 역할을 하는 중요한 두 번째 메신저 역할을 합니다. 또한, 인간 CACNA1A 유전자에 의해 암호화되는 시냅스전 P/Q 채널의 위상 요소는 글루타메이트30,31,32를 포함한 다양한 신경 전달 물질의 배출을 매개하는 것으로 확인되었으며 간질33,34와 밀접하게 연결되어 있습니다. 이전에, Cac 넉다운 파리의 행동은 일부 돌연변이에서 보고된 심각성을 나타내지 않았으며, 심지어 특정 이중 돌연변이 파리에서 억제 효과를 나타내기까지 하였다(35). 이 연구의 결과는 cac 넉다운 파...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 광둥 기초 및 응용 기초 연구 재단(Jing-Da Qiao에 보조금 번호 2022A151111123)의 지원을 받았으며 GMU(Jing-Da Qiao)의 과학 연구를 강화할 계획입니다. 이 작업은 광저우 의과대학 학생 혁신 능력 향상 계획(자금 지원 번호 02-408-2304-02038XM)의 지원도 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
파리 취급용브러시 PaneraAAhc022-2
염화칼슘(CaCl2)Sigma-AldrichC4901
컨포칼 현미경SP8; 자이스, 예나, 독일.칼슘 이미징
CO2 마취 기계에N/A를 마취하기 위한N/A
C-샤프 홀더N/AN/A핸드메이드, 뇌 장착용
배양 바이알Biologix51-0500직경 2.5cm, 높이 9.5cm
피지 소프트웨어미국 국립 보건원 베데스다, 메릴랜드, 미국버전: 2.14.0분석용
플라이 시체N/A핸드메이드, 플라이
재고cac-RNAi27244from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocksGCaMP6m42750from Bloomington Drosophila Stock Center
플라이 주식tub-Gal4N/Afrom the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
GlucoseSigma-AldrichG8270
고해상도 카메라N/AN/A 분석
L-라이신Sigma-AldrichL5626
염화마그네슘 용액(MgCl2)Sigma-AldrichM1028
Papain 현탁액Worthington BiochemicalLS003126
Petri Dish, Sigma-AldrichSLW1480/02Dfor dissection
PipetteThermo Scientific4640010, 4640030, 4640050, 4640060측정된 부피의 액체 및 해체된 뇌를 운반하기 위한
염화칼륨(KCl)Sigma-AldrichP4504
기록 접시Thermo Scientific150682- 뇌및 칼슘 이미징을 담기 위한
중탄산나트륨(NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
염화나트륨( NaCl)Sigma-AldrichS5886
수산화나트륨(NaOH)Fisher ScientificS25550
인산나트륨 일염기성(NaH2PO4)Sigma-AldrichS8282
파리및 해부SHANG GUANGXTZ-D
PYTHONBIO해부를 위한HCL0693
삼각대WEIFENG45634732523발작과 유사한 행동 분석을 기록하기 위한
Vortex 믹서Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-AldrichZ653438발작과 같은 행동 분석을 수행하기 위해
화이트보드N/AN/A핸드메이드, 배경용 폼 패드 또는 종이
대한 파리. 발작과 같은 행동을 기록하기 위한 , , 것입니다 유리 기반 접시주사기 바늘 처리를 위한

참고문헌

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