पूर्व वीवो मिर्गी के ड्रोसोफिला मॉडल के लिए कैल्शियम इमेजिंग
Summary
यहां, हम एपिलेप्टिफॉर्म गतिविधियों की निगरानी के लिए GCaMP6-व्यक्त वयस्क ड्रोसोफिला में पूर्व विवो कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रोटोकॉल पूर्व विवो कैल्शियम इमेजिंग के माध्यम से वयस्क ड्रोसोफिला में ictal घटनाओं की जांच के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है, सेलुलर स्तर पर मिर्गी के संभावित तंत्र की खोज के लिए अनुमति देता है।
Abstract
मिर्गी एक न्यूरोलॉजिकल विकार है जो आवर्तक दौरे की विशेषता है, आंशिक रूप से आनुवंशिक उत्पत्ति के साथ सहसंबद्ध है, जो दुनिया भर में 70 मिलियन से अधिक व्यक्तियों को प्रभावित करता है। मिर्गी के नैदानिक महत्व के बावजूद, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में तंत्रिका गतिविधि का कार्यात्मक विश्लेषण अभी भी विकसित किया जाना है। इमेजिंग प्रौद्योगिकी में हालिया प्रगति, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों, जैसे कि GCaMP6 की स्थिर अभिव्यक्ति के संयोजन में, मस्तिष्क-व्यापी और एकल-कोशिका रिज़ॉल्यूशन स्तरों दोनों पर मिर्गी के अध्ययन में क्रांति ला दी है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर अपने परिष्कृत आणविक आनुवंशिकी और व्यवहार परख के कारण मिर्गी के अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र की जांच के लिए एक उपकरण के रूप में उभरा है। इस अध्ययन में, हम मिर्गी गतिविधियों की निगरानी के लिए GCaMP6-व्यक्त वयस्क ड्रोसोफिला में पूर्व विवो कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक उपन्यास और कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। पूरे मस्तिष्क को सीएसी, एक प्रसिद्ध मिर्गी जीन से तैयार किया जाता है, जो बैंग-संवेदनशील जब्ती-जैसे व्यवहार परख के अनुवर्ती के रूप में तंत्रिका गतिविधि की पहचान करने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ कैल्शियम इमेजिंग के लिए नॉकडाउन मक्खियों को मारता है। सीएसी नॉकडाउन मक्खियों ने जब्ती जैसे व्यवहार और असामान्य कैल्शियम गतिविधियों की उच्च दर दिखाई, जिसमें जंगली प्रकार की मक्खियों की तुलना में अधिक बड़े स्पाइक्स और कम छोटे स्पाइक्स शामिल हैं। कैल्शियम गतिविधियों को जब्ती जैसे व्यवहार से सहसंबद्ध किया गया था। यह पद्धति मिर्गी के लिए रोगजनक जीन की जांच करने और सेलुलर स्तर पर मिर्गी के संभावित तंत्र की खोज करने में एक कुशल पद्धति के रूप में कार्य करती है।
Introduction
मिर्गी, एक जटिल पुरानी न्यूरोलॉजिकल विकार जो सहज और अकारण बरामदगी और असामान्य न्यूरोनल नेटवर्क गतिविधि की पुनरावृत्ति की विशेषता है, ने दुनिया भर में 70 मिलियन से अधिक व्यक्तियों को प्रभावित किया है, जिससे यह सबसे आम न्यूरोलॉजिकलबीमारियों में से एक है 1 और परिवारों और समाज के भारी बोझ के लिए अग्रणी। मिर्गी के प्रभाव को ध्यान में रखते हुए, दौरे के एटियलजि की पहचान करने के लिए कई अध्ययन किए गए हैं, जिनमें से आनुवंशिकी को कई प्रकार के मिर्गी या मिर्गी सिंड्रोम2 के प्राथमिक कारण के रूप में अनुमोदित किया गया है। पिछले दशकों से, जीनोमिक प्रौद्योगिकियों में प्रगति ने उपन्यास मिर्गी से जुड़े जीन, जो आयन चैनल और गैर-आयन चैनल जीन 3,4 सहित जब्ती घटना में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, की खोज में तेजी से वृद्धि हुई है। हालांकि, जीन और मिर्गी के फेनोटाइप के बीच अंतर्निहित तंत्र और कार्यात्मक विश्लेषण अपूर्ण रूप से समझा जाता है। मिर्गी से जुड़े जीन और तंत्र की पहचान कुशलतापूर्वक 5,6 रोगियों के प्रबंधन के लिए संभावना प्रदान करता है.
साइटोसोलिक कैल्शियम सिग्नल न्यूरोनल गतिविधि और सिनैप्टिक ट्रांसमिशन में महत्वपूर्ण तत्व हैं। मस्तिष्क स्लाइस7 सहित कैल्शियम इमेजिंग, विवो 8,9, और ईएक्स विवो10 में, 1970 के दशक12,13 के बाद से न्यूरोनल उत्तेजना के लिए एक मार्कर के रूप में न्यूरोनल गतिविधि11 की निगरानी के लिए उपयोग किया गया है। इमेजिंग प्रौद्योगिकी में हाल की प्रगति, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) के साथ संयोजन में, जैसे कि जीसीएएमपी 6, ने मस्तिष्क-व्यापी और एकल-कोशिका रिज़ॉल्यूशन स्तर 14,15,16 दोनों पर मिर्गी के अध्ययन में क्रांति ला दी है, जिसमें उच्च स्तर की स्थानिक परिशुद्धता है। कैल्शियम एकाग्रता और यात्रियों में परिवर्तन कार्रवाई क्षमता और synaptic संचरण में मनाया गया, क्रमशः14, intracellular कैल्शियम के स्तर के परिवर्तन का संकेत न्यूरॉन्स 17,18 की विद्युत excitability के साथ एक सख्त सहसंबंध प्रदर्शित करता है. कैल्शियम इमेजिंग भी एक विकासात्मक जब्ती मॉडल9 के रूप में लागू किया गया है और एंटीकोनवल्सी यौगिकों19 स्क्रीनिंग के लिए ड्रोसोफिला में प्रदर्शन किया गया है.
ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर वैज्ञानिक अनुसंधान में एक शक्तिशाली मॉडल जीव के रूप में उभर रहा है, जैसे कि मिर्गी, इसके परिष्कृत आणविक आनुवंशिकी और व्यवहार परख20,21,22 के लिए। इसके अलावा, ड्रोसोफिला में उन्नत आनुवंशिक उपकरणों ने आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक GCaMP6 की अभिव्यक्ति में योगदान दिया है। उदाहरण के लिए, Gal4 और UAS- आधारित बाइनरी ट्रांसक्रिप्शनल सिस्टम GCaMP6 की विशिष्ट अभिव्यक्ति को स्थानिक और अस्थायी रूप से नियंत्रित तरीके से सक्षम करते हैं। ड्रोसोफिला एक छोटे से जीव है, विवो कैल्शियम इमेजिंग में कुशल आपरेशन कौशल की आवश्यकता होती है एक शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप, जिसमें मस्तिष्क के पृष्ठीय का केवल एक छोटा सा हिस्सा14,23 एक छोटी सी खिड़की के माध्यम से उजागर किया गया था प्रदर्शन करने के लिए. इसी समय, ड्रोसोफिला के बरकरार मस्तिष्क में पूर्व विवो कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग पूरे मस्तिष्क के ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) की निगरानी के लिए किया जा सकता है।
इस अध्ययन में, हम मिर्गी गतिविधियों की निगरानी के लिए GCaMP6-व्यक्त वयस्क ड्रोसोफिला में पूर्व विवो कैल्शियम इमेजिंग प्रस्तुत करते हैं। CACNA1A एक प्रसिद्ध मिर्गी जीन है, सीएसी कैव 2 चैनल से संबंधित है, जो CACNA1A के लिए एक होमोलॉग है। हमने cac knockdown मक्खियों टब-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi के दिमाग को विच्छेदित करके और xyt स्कैनिंग मोड के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उन्हें इमेजिंग करके शुरू किया। हमने तब संकेतकों की गणना करके आरओआई के कैल्शियम संकेतों में परिवर्तन का विश्लेषण किया जो सहज जब्ती जैसी घटनाओं की मात्रा निर्धारित करते हैं, जैसे कि % ΔF / F मान और GCaMP6 प्रतिदीप्ति की कैल्शियम घटनाएं। इसके अतिरिक्त, हमने कैल्शियम इमेजिंग के परिणामों को मान्य करने के लिए सीएसी-नॉकडाउन मक्खियों पर जब्ती व्यवहार परीक्षणों को प्रेरित करने के लिए भंवर मशीन द्वारा यांत्रिक उत्तेजना का प्रदर्शन किया। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल पूर्व विवो कैल्शियम इमेजिंग के माध्यम से वयस्क ड्रोसोफिला में ictal घटनाओं की जांच के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है, जो सेलुलर स्तरों पर मिर्गी के संभावित तंत्र की खोज के लिए अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कैल्शियम आयन एक महत्वपूर्ण दूसरे संदेशवाहक के रूप में कार्य करता है, जो रासायनिक और विद्युत गड़बड़ी दोनों के लिए शारीरिक और पैथोफिजियोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला में महत्वपूर्ण भूमिका निभा…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को ग्वांगडोंग बेसिक एंड एप्लाइड बेसिक रिसर्च फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2022A1515111123 से जिंग-दा किआओ) द्वारा समर्थित किया गया था और जीएमयू (जिंग-दा किआओ) में वैज्ञानिक अनुसंधान को बढ़ाने की योजना है। इस काम को गुआंगज़ौ मेडिकल यूनिवर्सिटी स्टूडेंट इनोवेशन एबिलिटी एनिसमेंट प्लान (फंडिंग नंबर 02-408-2304-02038XM) द्वारा भी समर्थित किया गया था।
Materials
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
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