Eks Vivo Kalsiumavbildning for Drosophila modell av epilepsi
Summary
Her presenterer vi en protokoll for ex vivo kalsiumavbildning i GCaMP6-uttrykkende voksen Drosophila for å overvåke epileptiforme aktiviteter. Protokollen gir et verdifullt verktøy for å undersøke iktale hendelser i voksen Drosophila gjennom ex vivo kalsiumavbildning, noe som muliggjør utforskning av potensielle mekanismer for epilepsi på cellenivå.
Abstract
Epilepsi er en nevrologisk lidelse preget av tilbakevendende anfall, delvis korrelert med genetisk opprinnelse, som påvirker over 70 millioner individer over hele verden. Til tross for den kliniske betydningen av epilepsi, er den funksjonelle analysen av nevral aktivitet i sentralnervesystemet fortsatt utviklet. Nylige fremskritt innen bildebehandlingsteknologi, i kombinasjon med stabilt uttrykk for genetisk kodede kalsiumindikatorer, som GCaMP6, har revolusjonert studiet av epilepsi på både hjernebrede og enkeltcelleoppløsningsnivåer. Drosophila melanogaster har dukket opp som et verktøy for å undersøke molekylære og cellulære mekanismer som ligger til grunn for epilepsi på grunn av sin sofistikerte molekylære genetikk og atferdsanalyser. I denne studien presenterer vi en ny og effektiv protokoll for ex vivo kalsiumavbildning i GCaMP6-uttrykkende voksen Drosophila for å overvåke epileptiforme aktiviteter. Hele hjernen er utarbeidet fra cac, et velkjent epilepsigen, knockdownfluer for kalsiumavbildning med et konfokalmikroskop for å identifisere nevralaktiviteten som en oppfølging av den bang-sensitive anfallslignende atferdsanalysen. Cac knockdown-fluene viste en høyere grad av anfallslignende oppførsel og unormale kalsiumaktiviteter, inkludert flere store pigger og færre små pigger enn villtype fluer. Kalsiumaktivitetene var korrelert med anfallslignende atferd. Denne metoden fungerer som en effektiv metodikk i screening av patogene gener for epilepsi og utforske den potensielle mekanismen for epilepsi på mobilnivå.
Introduction
Epilepsi, en kompleks kronisk nevrologisk lidelse preget av gjentakelse av spontane og uprovoserte anfall og avvikende nevronnettverksaktivitet, har påvirket over 70 millioner individer over hele verden, noe som gjør den til en av de vanligste nevrologiske sykdommene1 og fører til de store byrdene av familier og samfunn. Med tanke på virkningen av epilepsi har det blitt utført mange studier for å identifisere etiologien til anfall, hvorav genetikk er godkjent som en primær årsak til mange typer epilepsier eller epileptiske syndromer2. I de siste tiårene har fremskritt innen genomiske teknologier ført til en rask økning i oppdagelsen av nye epilepsiassosierte gener, som spiller en avgjørende rolle i anfallsforekomst, inkludert ionkanaler og ikke-ionkanalgener 3,4. Imidlertid er de underliggende mekanismene og funksjonsanalysen mellom genene og epileptiske fenotyper ufullstendig forstått. Identifisering av epilepsiassosierte gener og mekanismer gir mulighet for effektiv behandling av pasienter 5,6.
Cytosoliske kalsiumsignaler er sentrale elementer i nevronaktivitet og synaptisk overføring. Kalsiumavbildning, inkludert hjerneskiver7, in vivo 8,9 og ex vivo10, har blitt brukt til å overvåke nevronaktivitet11 som en markør for nevronal eksitabilitet siden1970-tallet 12,13. Nylige fremskritt innen bildebehandlingsteknologi, i kombinasjon med de genetisk kodede kalsiumindikatorene (GECI), som GCaMP6, har revolusjonert studiet av epilepsi ved både hjernebrede og enkeltcelleoppløsningsnivåer 14,15,16, som har et høyt nivå av spatiotemporal presisjon. Endringer i kalsiumkonsentrasjon og transienter ble observert i henholdsvis aksjonspotensialer og synaptisk overføring14, noe som indikerer at endringen av intracellulære kalsiumnivåer viser en streng korrelasjon med den elektriske eksitabiliteten til nevroner17,18. Kalsiumavbildning har også blitt brukt som en utviklingsanfallsmodell9 og utført i Drosophila for screening av antikonvulsive forbindelser19.
Drosophila melanogaster har dukket opp som en kraftig modellorganisme i vitenskapelig forskning, som epilepsi, for sin sofistikerte molekylære genetikk og atferdsanalyser 20,21,22. Videre har de avanserte genetiske verktøyene i Drosophila bidratt til uttrykket av genetisk kodet kalsiumindikator GCaMP6. For eksempel muliggjør Gal4- og UAS-baserte binære transkripsjonssystemer spesifikt uttrykk for GCaMP6 på en romlig og tidsmessig kontrollert måte. Siden Drosophila er en liten organisme, krever in vivo kalsiumavbildning dyktige operasjonsevner for å utføre et kirurgisk inngrep, hvor bare en liten del av hjernens dorsale ble eksponert gjennom et lite vindu14,23. Samtidig kan ex vivo kalsiumavbildning i den intakte hjernen til Drosophila brukes til å overvåke interesseområdene (ROI) i hele hjernen.
I denne studien presenterer vi ex vivo kalsiumavbildning i GCaMP6-uttrykkende voksen Drosophila for å overvåke epileptiforme aktiviteter. CACNA1A er et velkjent epilepsigen, tilhører cac Cav2-kanalen, som er en homolog til CACNA1A. Vi begynte med å dissekere hjernen til cac knockdown fluer tub-Gal4>GCaMP6m / cac-RNAi og avbilde dem ved hjelp av et konfokalmikroskop med xyt skanningsmodus. Vi analyserte deretter endringene i kalsiumsignaler av avkastning ved å beregne indikatorer som kvantifiserer spontane anfallslignende hendelser, for eksempel% ΔF / F-verdi og kalsiumhendelser av GCaMP6-fluorescens. I tillegg utførte vi mekanisk stimulans av virvelmaskin for å indusere anfallsadferdstester på cac-knockdownfluer, samt for å validere resultatene av kalsiumavbildning. Samlet sett gir denne protokollen et verdifullt verktøy for å undersøke iktale hendelser i voksen Drosophila gjennom ex vivo kalsiumavbildning, noe som muliggjør utforskning av potensielle mekanismer for epilepsi på cellenivå.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kalsiumionet fungerer som en avgjørende andre budbringer, og spiller en sentral rolle i en rekke fysiologiske og patofysiologiske responser på både kjemiske og elektriske forstyrrelser. Videre har det topologiske elementet i de presynaptiske P / Q-kanalene, kodet av det humane CACNA1A-genet, blitt identifisert som ansvarlig for å formidle utslipp av forskjellige nevrotransmittere, inkludert glutamat 30,31,32, og er nært knyttet til epilepsi</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (stipendnr. 2022A1515111123 til Jing-Da Qiao) og planlegger å styrke vitenskapelig forskning i GMU (Jing-Da Qiao). Dette arbeidet ble også støttet av Guangzhou Medical University Student Innovation Ability Enihancement Plan (finansiering nr. 02-408-2304-02038XM).
Materials
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
- Thijs, R. D., Surges, R., O’brien, T. J., Sander, J. W. Epilepsy in adults. Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al. Epilepsy-associated genes. Seizure. 44, 11-20 (2017).
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. 유전학. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O’dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O’dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -. Q., Lin, Y. -. M., Zhang, X. -. X., Peng, R. -. C., Qiao, J. -. D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i., Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. Plos Genetics. 15 (11), e1008421 (2019).
