Ex vivo Кальциевая визуализация для модели эпилепсии дрозофилы
Summary
Здесь мы представляем протокол визуализации ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. Протокол предоставляет ценный инструмент для исследования иктальных событий у взрослых дрозофил с помощью визуализации кальция ex vivo , что позволяет исследовать потенциальные механизмы эпилепсии на клеточном уровне.
Abstract
Эпилепсия – это неврологическое расстройство, характеризующееся рецидивирующими припадками, частично коррелированными с генетическим происхождением, которым страдают более 70 миллионов человек во всем мире. Несмотря на клиническое значение эпилепсии, функциональный анализ нервной активности в центральной нервной системе еще предстоит разработать. Недавние достижения в технологии визуализации в сочетании со стабильной экспрессией генетически кодируемых индикаторов кальция, таких как GCaMP6, произвели революцию в изучении эпилепсии как на уровне мозга, так и на уровне отдельных клеток. Drosophila melanogaster появилась как инструмент для исследования молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе эпилепсии, благодаря своей сложной молекулярной генетике и поведенческим анализам. В этом исследовании мы представляем новый и эффективный протокол визуализации ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. Весь мозг подготавливается из cac, хорошо известного гена эпилепсии, для визуализации кальция с помощью конфокального микроскопа, чтобы идентифицировать нейронную активность в качестве последующего анализа на судорожное поведение. Мухи-нокдауны CAC показали более высокую частоту судорожного поведения и аномальную активность кальция, включая более крупные шипы и меньшее количество мелких шипов, чем мухи дикого типа. Активность кальция коррелировала с судорожным поведением. Эта методология служит эффективной методологией скрининга патогенных генов эпилепсии и изучения потенциального механизма эпилепсии на клеточном уровне.
Introduction
Эпилепсия, сложное хроническое неврологическое расстройство, характеризующееся рецидивами спонтанных и неспровоцированных припадков и аберрантной активностью нейронной сети, затронула более 70 миллионов человек во всем мире, что делает ее одним из наиболее распространенных неврологическихзаболеваний1 и приводит к тяжелому бремени для семей и общества. Принимая во внимание влияние эпилепсии, было проведено множество исследований для определения этиологии припадков, из которых генетика была признана основной причиной многих типов эпилепсии или эпилептическихсиндромов. За последние десятилетия достижения в области геномных технологий привели к быстрому увеличению числа открытий новых генов, связанных с эпилепсией, которые играют решающую роль в возникновении судорог, включая гены ионных каналов и неионных каналов 3,4. Тем не менее, основные механизмы и функциональный анализ между генами и эпилептическими фенотипами до конца не изучены. Идентификация генов и механизмов, связанных с эпилепсией, дает возможность эффективно вести пациентов 5,6.
Цитозольные кальциевые сигналы являются ключевыми элементами нейрональной активности и синаптической передачи. Визуализация кальция, включая срезы мозга7, in vivo 8,9 и ex vivo10, используется для мониторинга активности нейронов11 в качестве маркера возбудимости нейроновс 1970-х годов 12,13. Недавние достижения в технологии визуализации в сочетании с генетически кодируемыми кальциевыми индикаторами (GECI), такими как GCaMP6, произвели революцию в изучении эпилепсии как на уровне мозга, так и на уровне разрешения одной клетки14, 15, 16, что имеет высокий уровень пространственно-временной точности. Изменения концентрации кальция и переходных процессов наблюдались в потенциалах действия и синаптической передаче соответственно14, что указывает на то, что изменение внутриклеточных уровней кальция проявляет строгую корреляцию с электрической возбудимостью нейронов17,18. Визуализация кальция также применялась в качестве модели судорогразвития 9 и выполнялась у дрозофилы для скрининга противосудорожных соединений19.
Drosophila melanogaster становится мощным модельным организмом в научных исследованиях, таких как эпилепсия, благодаря своей сложной молекулярной генетике и поведенческим тестам 20,21,22. Более того, усовершенствованные генетические инструменты дрозофилы способствовали экспрессии генетически кодируемого кальциевого индикатора GCaMP6. Например, бинарные транскрипционные системы на основе Gal4 и UAS обеспечивают специфическую экспрессию GCaMP6 пространственно и во времени. Поскольку дрозофила является крошечным организмом, визуализация кальция in vivo требует профессиональных операционных навыков для выполнения хирургического вмешательства, при котором только небольшая часть спинного мозга обнажалась через маленькое окно14,23. В то же время, визуализация кальция ex vivo в интактном мозге дрозофилы может быть использована для мониторинга областей интереса (ROI) всего мозга.
В этом исследовании мы представляем визуализацию ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. CACNA1A является хорошо известным геном эпилепсии, CAC относится к каналу Cav2, который является гомологом CACNA1A. Мы начали с препарирования мозга мух-нокдаунов САС tub-Gal4>GCaMP6m/cac-RNAi и визуализации их с помощью конфокального микроскопа с режимом рентгеновского сканирования. Затем мы проанализировали изменения кальциевых сигналов ROI, рассчитав показатели, которые количественно оценивают спонтанные судорожные события, такие как значение %ΔF/F и кальциевые события флуоресценции GCaMP6. Кроме того, мы проводили механический стимул с помощью вихревой машины, чтобы индуцировать тесты на судорожное поведение мух, нокдаунов CAC, а также валидировать результаты визуализации кальция. В целом, этот протокол предоставляет ценный инструмент для исследования иктальных событий у взрослых дрозофил с помощью визуализации кальция ex vivo, что позволяет исследовать потенциальные механизмы эпилепсии на клеточном уровне.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ион кальция служит важным вторым мессенджером, играя ключевую роль в ряде физиологических и патофизиологических реакций как на химические, так и на электрические возмущения. Кроме того, топологический элемент пресинаптических P/Q-каналов, кодируемый геном CACNA1A человека, был иденти…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Гуандунским фондом фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований (грант No 2022A1515111123 Jing-Da Qiao) и планом по расширению научных исследований в GMU (Jing-Da Qiao). Эта работа также была поддержана Планом развития инновационных способностей студентов Медицинского университета Гуанчжоу (No финансирования 02-408-2304-02038XM).
Materials
| Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
| CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
| C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
| Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
| Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
| Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
| Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
| Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
| Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
| Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
| Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
| Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
| Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
| Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
| Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
References
- Thijs, R. D., Surges, R., O’brien, T. J., Sander, J. W. Epilepsy in adults. Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).
- Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. 19 (1), 93-100 (2020).
- Wang, J., et al. Epilepsy-associated genes. Seizure. 44, 11-20 (2017).
- Oliver, K. L., et al. Genes4epilepsy: An epilepsy gene resource. Epilepsia. 64 (5), 1368-1375 (2023).
- Rogawski, M. A., Loscher, W., Rho, J. M. Mechanisms of action of antiseizure drugs and the ketogenic diet. Cold Spring Harb Perspect Med. 6 (5), 022780 (2016).
- Ademuwagun, I. A., Rotimi, S. O., Syrbe, S., Ajamma, Y. U., Adebiyi, E. Voltage gated sodium channel genes in epilepsy: Mutations, functional studies, and treatment dimensions. Front Neurol. 12, 600050 (2021).
- Leweke, F. M., Louvel, J., Rausche, G., Heinemann, U. Effects of pentetrazol on neuronal activity and on extracellular calcium concentration in rat hippocampal slices. Epilepsy Res. 6 (3), 187-198 (1990).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nat Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hewapathirane, D. S., Dunfield, D., Yen, W., Chen, S., Haas, K. In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Exp Neurol. 211 (2), 480-488 (2008).
- Ishimoto, H., Sano, H. Ex vivo calcium imaging for visualizing brain responses to endocrine signaling in drosophila. J Vis Exp. 136, 57701 (2018).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Moisescu, D. G., Ashley, C. C., Campbell, A. K. Comparative aspects of the calcium-sensitive photoproteins aequorin and obelin. Biochim Biophys Acta. 396 (1), 133-140 (1975).
- Blinks, J. R., Prendergast, F. G., Allen, D. G. Photoproteins as biological calcium indicators. Pharmacol Rev. 28 (1), 1-93 (1976).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved gcamp calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
- Rochefort, N. L., Jia, H., Konnerth, A. Calcium imaging in the living brain: Prospects for molecular medicine. Trends Mol Med. 14 (9), 389-399 (2008).
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. Br J Pharmacol. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Neher, E., Sakaba, T. Multiple roles of calcium ions in the regulation of neurotransmitter release. Neuron. 59 (6), 861-872 (2008).
- Streit, A. K., Fan, Y. N., Masullo, L., Baines, R. A. Calcium imaging of neuronal activity in drosophila can identify anticonvulsive compounds. PLoS One. 11 (2), 0148461 (2016).
- Parker, L., Howlett, I. C., Rusan, Z. M., Tanouye, M. A. Seizure and epilepsy: Studies of seizure disorders in drosophila. Int Rev Neurobiol. 99, 1-21 (2011).
- Del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in drosophila. Nat Methods. 9 (1), 47-55 (2011).
- Liu, C. Q., et al. Efficient strategies based on behavioral and electrophysiological methods for epilepsy-related gene screening in the drosophila model. Front Mol Neurosci. 16, 1121877 (2023).
- Wang, Y., et al. Genetic manipulation of the odor-evoked distributed neural activity in the drosophila mushroom body. Neuron. 29 (1), 267-276 (2001).
- Wang, J., et al. Unc13b variants associated with partial epilepsy with favourable outcome. Brain. 144 (10), 3050-3060 (2021).
- Ganetzky, B., Wu, C. F. Indirect suppression involving behavioral mutants with altered nerve excitability in drosophila melanogaster. 유전학. 100 (4), 597-614 (1982).
- Roemmich, A. J., Schutte, S. S., O’dowd, D. K. Ex vivo whole-cell recordings in adult drosophila brain. Bio Protoc. 8 (14), 2467 (2018).
- Gu, H., O’dowd, D. K. Whole cell recordings from brain of adult drosophila. J Vis Exp. (6), 248 (2007).
- Qiao, J., Yang, S., Geng, H., Yung, W. H., Ke, Y. Input-timing-dependent plasticity at incoming synapses of the mushroom body facilitates olfactory learning in drosophila. Curr Biol. 32 (22), 4869-4880 (2022).
- Liu, C. -. Q., Lin, Y. -. M., Zhang, X. -. X., Peng, R. -. C., Qiao, J. -. D. Protective effect of CACNA1A deficiency against seizure in the CACNA1A-CELSR2 digenic knockdown flies. Research Square. , (2023).
- Uchitel, O. D., Inchauspe, C. G., Urbano, F. J. D. i., Guilmi, M. N. Cav2.1 voltage activated calcium channels and synaptic transmission in familial hemiplegic migraine pathogenesis. J Physiol Paris. 106 (1-2), 12-22 (2012).
- Le Roux, M., et al. Cacna1a-associated epilepsy: Electroclinical findings and treatment response on seizures in 18 patients. Eur J Paediatr Neurol. 33, 75-85 (2021).
- Alehabib, E., et al. Clinical and molecular spectrum of p/q type calcium channel cav2.1 in epileptic patients. Orphanet J Rare Dis. 16 (1), 461 (2021).
- Li, X. L., et al. Cacna1a mutations associated with epilepsies and their molecular sub-regional implications. Front Mol Neurosci. 15, 860662 (2022).
- Indelicato, E., Boesch, S. From genotype to phenotype: Expanding the clinical spectrum of cacna1a variants in the era of next generation sequencing. Front Neurol. 12, 639994 (2021).
- Saras, A., Tanouye, M. A. Mutations of the calcium channel gene cacophony suppress seizures in drosophila. Plos Genetics. 12 (1), e1005784 (2016).
- Cozzolino, O., et al. Evolution of epileptiform activity in zebrafish by statistical-based integration of electrophysiology and 2-photon ca2+ imaging. Cells. 9 (3), 769 (2020).
- Mituzaite, J., Petersen, R., Claridge-Chang, A., Baines, R. A. Characterization of seizure induction methods in drosophila. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. Plos Genetics. 15 (11), e1008421 (2019).
