Mikrodisseksjon og immunfluorescensfarging av myokardhylser i murine lungevener
Summary
Denne protokollen viser mikroskopiveiledet isolasjon og immunfluorescensfarging av murine lungevener. Vi forbereder vevsprøver som inneholder venstre atrium, lungevener og tilhørende lunger og flekker dem for hjertetroponin T og Connexin 43.
Abstract
Lungevener (PV) er den viktigste kilden til ektopiske slag i atrielle arytmier og spiller en avgjørende rolle i utvikling og progresjon av atrieflimmer (AF). PV inneholder myokardhylser (MS) sammensatt av kardiomyocytter. MS er involvert i initiering og vedlikehold av AF, da de bevarer likheter med hjertets arbeidende myokard, inkludert evnen til å generere ektopiske elektriske impulser. Gnagere er mye brukt og kan representere gode dyremodeller for å studere lungevenemyokardiet siden kardiomyocytter er allment tilstede over hele karveggen. Imidlertid er presis mikrodisseksjon og fremstilling av murine PV utfordrende på grunn av liten organstørrelse og intrikat anatomi.
Vi demonstrerer en mikroskopiveiledet mikrodisseksjonsprotokoll for isolering av murine venstre atrium (LA) sammen med PVene. Immunfluorescensfarging ved bruk av hjerte Troponin-T (cTNT) og connexin 43 (Cx43) antistoffer utføres for å visualisere LA og PV i full lengde. Avbildning ved 10x og 40x forstørrelse gir en omfattende oversikt over PV-strukturen, samt detaljert innsikt i myokardarkitekturen, spesielt fremhever tilstedeværelsen av connexin 43 i MS.
Introduction
Atrieflimmer (AF) er den vanligste vedvarende arytmien1. Utbredelsen av atrieflimmer øker ytterligere med et forventet antall ~17,9 millioner pasienter i Europa i 20601. AF er klinisk svært viktig siden det er en viktig risikofaktor for utvikling av hjerteinfarkt, hjertesvikt eller hjerneslag, noe som resulterer i en enorm individuell, sosial og sosioøkonomisk byrde1. Selv om atrieflimmer har vært kjent i flere tiår, er patofysiologien ved atrieflimmer fortsatt ikke fullt ut forstått2.
Allerede på slutten av 1990-tallet viste studier den store effekten av lungevener (PV) i å initiere og opprettholde AF, da de er hovedkilden til AF-utløsende ektopiske slag3. Det har vist seg at PV strukturelt skiller seg fra andre blodkar. Mens typiske blodkar inneholder glatte muskelceller, inneholder tunikamediet til PV også kardiomyocytter4. Hos gnagere er denne hjertemuskulaturen allestedsnærværende i hele PV, inkludert intra- og ekstrapulmonale deler, samt åpningsregionen5. Hos mennesker inneholder PV også kardiomyocytter, som kan observeres i forlengelser av venstre atriell (LA) myokard – såkalte myokardhylser (MS) 6,7.
MS har morfologiske likheter med atriemyokard8. Formen og størrelsen på atrielle og PV kardiomyocytter varierer ikke signifikant mellom hverandre og viser sammenlignbare elektrofysiologiske egenskaper8. Elektrofysiologiske registreringer i PV har bevist den elektriske aktiviteten til MS, og angiografisk avbildning har avslørt sammentrekninger synkronisert med hjerteslag 9,10.
Gapkryss er poredannende proteinkomplekser sammensatt av seks connexin-underenheter, som tillater passasje av ioner og små molekyler11. Gap-kryss finnes i celle-til-celle-apposisjoner, forbinder nærliggende kardiomyocytter, og muliggjør en intercellulær elektrisk kobling mellom kardiomyocytter12,13. Flere connexinisoformer uttrykkes i hjertet med connexin 43 (Cx43) som den vanligste isoformen uttrykt i alle regioner i hjertet14. Tidligere studier gir holdepunkter for ekspresjon av Cx43 i kardiomyocytter av PV 15,16.
Det er fortsatt utfordrende å undersøke MS i intakte PV på grunn av deres delikate struktur, spesielt i små dyremodeller. Her demonstrerer vi hvordan man identifiserer og isolerer PV sammen med LA og lungelapper hos mus ved hjelp av mikroskopiveiledet mikrodisseksjon. I tillegg demonstrerer vi immunfluorescens (IF) farging av PV for å visualisere kardiomyocytter og deres sammenkoblinger i PVene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med denne protokollen deler vi en metode for å skille og isolere PVene i musehjertet og utføre immunfluorescensfarging på dem. Etter organhøstingen ble hjertet og lungene dehydrert i sterilisert sukroseløsning, etterfulgt av separering av ventriklene fra atrium og lungelapper under mikroskopisk veiledning. Etterpå ble hjertebasen forberedt på å visualisere PVene etterfulgt av å kutte dem fra lungene ved hilum. Den påfølgende immunfluorescensfargingen ble utført ved hjelp av en kryoteknikk ved å legge vevet i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av det tyske senteret for kardiovaskulær forskning (DZHK; 81X3600221til H.V., 81X2600255 til SC), China Scholarship Council (CSC201808130158 til RX), den tyske forskningsstiftelsen (DFG; Clinician Scientist Program in Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 til P. T.), og Corona Foundation (S199/10079/2019 til SC).
Materials
| Adhesion slides | Epredia | 10149870 | |
| AF568-secondary antibody | Invitrogen | A11036 | Host: Goat, Reactivity: Rabbit |
| Agarose | Biozym LE | 840104 | |
| Alexa Fluor 488-secondary antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Host: Goat, Reactivity: Mouse |
| Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody | Abcam | ab11370 | Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit |
| Anti-cTNT antibody | Invitrogen | MA5-12960 | Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Brush | Lukas | 5486 | size 6 |
| Cover slips | Epredia | 24 mm x 50 mm | |
| Cryotome Cryo Star NX70 | Epredia | Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C | |
| DFC365FX camera | Leica | ||
| DM6 B fluorescence microscope | Leica | ||
| Dry ice | |||
| Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc. | Gibco | 14040133 | 500 mL |
| Dumont #5FS Forceps | F.S.T. | 91150-20 | 2 pieces needed |
| Fine Scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Cell nuclei counterstaining |
| ImageJ | FIJI | analysis and processing software | |
| LAS X | Leica | Imaging software for Leica DM6 B | |
| Microtome blades S35 | Feather | 207500000 | |
| Microwave | |||
| Normal goat serum | Sigma-Aldrich | S26-M | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Paraformaldehyde 16% | Pierce | 28908 | methanol-free |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1681 | |
| Petri dish | TPP | 93100 | 100 mm diameter |
| Rocker 3D digital | IKA Schüttler | 00040010000 | |
| Slide staining jars | EasyDip | M900-12 | |
| Specimen Molds | Tissue-Tek Cryomold | 4557 | 25 mm x 20 mm x 5 mm |
| StainTray M920 staining system | StainTray | 631-1923 | Staining system for 20 slides |
| Sterican Needle | Braun | 4657705 | G 27 – used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol |
| Student Vannas Spring Scissors | F.S.T. | 91500-09 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Super PAP Pen | N71310-N | |
| Syringes | Braun | 4606108V | 10 mL |
| Tris base | Roche | TRIS-RO | component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 |
References
- Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
- Wijesurendra, R. S., Casadei, B. Mechanisms of atrial fibrillation. Heart. 105 (24), 1860-1867 (2019).
- Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
- Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
- Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
- Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
- Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
- Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432 (2020).
- Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
- Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
- Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
- Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
- Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
- Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
- Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
- Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
- Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
- Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
- Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23 (2021).
- Chen, P. S., et al. The mechanisms of atrial fibrillation. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 17, S2-S7 (2006).
- Thibault, S., Ton, A. -. T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696 (2022).
