В данной статье описана процедура получения iTenoцитов путем генерации мезенхимальных стромальных клеток, полученных из iPSC, с комбинированной гиперэкспрессией Scleraxis с использованием лентивирусного вектора и одноосным растяжением через 2D-биореактор.
Сегодняшние проблемы в восстановлении сухожилий и связок требуют определения подходящего и эффективного кандидата для клеточной терапии для стимуляции регенерации сухожилий. Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) были изучены как потенциальная стратегия тканевой инженерии для восстановления сухожилий. Несмотря на то, что они мультипотентны и обладают регенеративным потенциалом in vivo, они ограничены в своей способности к самообновлению и демонстрируют фенотипическую гетерогенность. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут обойти эти ограничения благодаря своей высокой способности к самообновлению и беспрецедентной пластичности развития. В развитии теноцитов склераксис (Scx) является важнейшим прямым молекулярным регулятором дифференцировки сухожилий. Кроме того, было показано, что механорегуляция является центральным элементом, управляющим развитием и заживлением эмбриональных сухожилий. Таким образом, мы разработали протокол для инкапсуляции синергетического эффекта биологической и механической стимуляции, который может быть важен для генерации теноцитов. ИПСК индуцировали превращение в мезенхимальные стромальные клетки (МСК) и характеризовали классическими мезенхимальными стромальными клеточными маркерами с помощью проточной цитометрии. Затем с помощью лентивирусного вектора iMSK трансдуцировали для стабильной сверхэкспрессии SCX (iMSCSCX+). Эти клеткиiMSC SCX+ могут быть дополнительно преобразованы в iTenoциты путем одноосного растягивающего нагружения с помощью 2D-биореактора. Полученные клетки характеризовались наблюдением за повышением регуляции ранних и поздних маркеров сухожилий, а также отложением коллагена. Этот метод генерации iTenoцитов может быть использован для помощи исследователям в разработке потенциально неограниченного готового аллогенного источника клеток для применения в терапии сухожильными клетками.
Чтобы решить современные проблемы восстановления сухожилий и связок, существует потребность в соответствующем клеточном кандидате, подходящем для клеточной терапии. Одним из направлений исследований в тканевой инженерии для восстановления сухожилий является изучение мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (BM-MSCs) и стромальных клеток жировой ткани (ASC) в качестве потенциальных стратегий. Эти клетки обладают мультипотентной способностью, большой численностью и регенеративным потенциалом in vivo. Кроме того, они показали повышенную способность к заживлению и улучшенные функциональные результаты на животных моделях1. Тем не менее, эти клетки демонстрируют ограниченные возможности самообновления, фенотипическое разнообразие и, что примечательно, ограниченную способность к образованию сухожилий. Технология индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) предлагает решение этих ограничений благодаря своей замечательной способности к самообновлению и непревзойденной адаптивности к развитию. Наша исследовательская группа и другие исследователи добились успешной дифференцировки ИПСК в мезенхимальные стромальноклеточные образования (МСК)2,3. Таким образом, МСК могут стать аллогенным источником для клеточной терапии сухожилий.
Склераксис (SCX) является транскрипционным фактором, необходимым для развития сухожилий, и считается самым ранним обнаруживаемым маркером дифференцированных теноцитов. Кроме того, SCX активирует маркеры дифференцировки сухожилий, в том числе коллаген 1-го типа (COL1a1), ирокез (MKX) и теномулина (TNMD), среди прочих 4,5,6. Другие гены, экспрессируемые во время созревания сухожилий, включают белка, способствующего полимеризации тубулина, члена семейства 3 (TPPP3) и рецептор тромбоцитарного фактора роста альфа (PDGFRa)7. Хотя эти гены необходимы для развития и созревания сухожилий, они, к сожалению, не уникальны для сухожильной ткани и экспрессируются в других костно-мышечных тканях, таких как кости или хрящи 5,7.
В дополнение к экспрессии маркеров во время развития сухожилий, механостимуляция является важным элементом для эмбрионального развития и заживления сухожилий 4,5,6. Сухожилия механочувствительны, и их модели роста изменяются в ответ на окружающую среду. На молекулярном уровне биомеханические сигналы влияют на развитие, созревание, поддержание и реакции заживления теноцитов8. Для моделирования физиологических нагрузок и биомеханических сигналов используются различные системы биореакторов. Некоторые из этих модельных систем включают в себя нагрузку тканей ex vivo, 2D-системы загрузки клеток, использующие двухосное или одноосное растяжение, и 3D-системы, использующие скаффолды и гидрогели 9,10. 2D-системы полезны при изучении влияния механической стимуляции либо на сухожильные специфические гены, либо на морфологию клеток в контексте клеточной судьбы, в то время как 3D-системы могут более точно воспроизводить взаимодействия между клеткой и ECM 9,10.
В системах 2D-загрузки деформация между клетками и культуральным субстратом однородна, что означает, что приложенная нагрузка на цитоскелет клеток может быть полностью контролируемой. По сравнению с двухосной нагрузкой, одноосная нагрузка более физиологически значима, так как теноциты преимущественно подвергаются одноосной нагрузке из коллагеновых пучков in vivo9. Установлено, что при повседневной деятельности сухожилия подвергаются одноосной растягивающей нагрузке до 6% деформации11. В частности, предыдущие исследования показали, что нагрузка в физиологических пределах 4%-5% способствует дифференцировке теногенов, сохраняя экспрессию маркеров, связанных с сухожилиями, таких как SCX и TNMD, а также увеличивает выработку коллагена 9,10. Штаммы более 10% могут быть травматичными, но не физиологически значимыми12,13.
Здесь представлен протокол, учитывающий синергетический эффект механической и биологической стимуляции, который может иметь существенное значение для генерации теноцитов. Впервые описан воспроизводимый метод индуцирования ИПСК в МСК путем кратковременного воздействия факторов роста на эмбриоидные тельца, подтвержденный поверхностными маркерами МСК с помощью проточной цитометрии. Затем мы подробно описали метод лентивирусной трансдукции, позволяющий сконструировать iMSC со стабильной гиперэкспрессией SCX (iMSCSCX+). Для дальнейшего созревания клеток iMSCSCX+ помещаются в силиконовые пластины с фибронектиновым покрытием и проходят оптимизированный протокол одноосного натяжения с использованием биореактора CellScale MCFX. Теногенный потенциал был подтвержден наблюдением за апрегуляцией ранних и поздних маркеров сухожилий, а также отложением коллагена14. Этот метод генерации iTenoцитs является доказательством концепции, которая может предложить неограниченный готовый аллогенный источник для применения в терапии сухожильными клетками.
В этом протоколе iTenoциты генерируются через три основных этапа: (1) индукция ИПСК в МСК, (2) гиперэкспрессия SCX с использованием лентивирусного вектора и (3) созревание клеток посредством 2D одноосного натяжения.
Представленный протокол дифференциации ИПСК в МСК был ранее оп?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было частично поддержано NIH/NIAMS K01AR071512 и CIRM DISC0-14350 Дмитрию Шейну. Две лентивирусные упаковочные плазмиды были подарком лаборатории Саймона Нотта (Департамент биомедицинских наук, Медицинский центр Седарс-Синай).
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
PBS | Thermofisher | 10010023 | |
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
Silicone plates | CellScale | N/A | |
Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |