Den här artikeln beskriver en procedur för att producera iTenocyter genom att generera iPSC-härledda mesenkymala stromaceller med kombinerat överuttryck av Scleraxis med hjälp av en lentiviral vektor och enaxlig sträckning via en 2D-bioreaktor.
Dagens utmaningar inom sen- och ligamentreparation gör det nödvändigt att identifiera en lämplig och effektiv kandidat för cellbaserad terapi för att främja senregenerering. Mesenkymala stromaceller (MSC) har undersökts som en potentiell vävnadsteknisk strategi för senreparation. Även om de är multipotenta och har regenerativ potential in vivo, är de begränsade i sin förmåga till självförnyelse och uppvisar fenotypisk heterogenitet. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) kan kringgå dessa begränsningar på grund av deras höga självförnyelseförmåga och oöverträffade utvecklingsplasticitet. I tenocytutveckling är Scleraxis (Scx) en avgörande direkt molekylär regulator för sendifferentiering. Dessutom har mekanoreglering visat sig vara en central faktor som styr utvecklingen och läkningen av embryonala senor. Som sådan har vi utvecklat ett protokoll för att kapsla in den synergistiska effekten av biologisk och mekanisk stimulering som kan vara avgörande för att generera tenocyter. iPSCs inducerades till att bli mesenkymala stromaceller (iMSCs) och karakteriserades med klassiska mesenkymala stromacellsmarkörer via flödescytometri. Därefter, med hjälp av en lentiviral vektor, transducerades iMSCs för att stabilt överuttrycka SCX (iMSCSCX+). Dessa iMSCSCX+ -celler kan vidaremogna till iTenocyter via enaxlig dragbelastning med hjälp av en 2D-bioreaktor. De resulterande cellerna karakteriserades genom att observera uppreglering av tidiga och sena senmarkörer, samt kollagenavlagring. Denna metod för att generera iTenocyter kan användas för att hjälpa forskare att utveckla en potentiellt obegränsad allogen cellkälla för sencellsterapiapplikationer.
För att ta itu med de samtida problemen inom reparation av senor och ligament finns det ett krav på en relevant cellkandidat som är lämplig för cellbaserade terapier. En forskningsväg inom vävnadsteknik för senreparation involverar utforskning av benmärgshärledda mesenkymala stromaceller (BM-MSC) och fettvävnadshärledda stromaceller (ASC) som potentiella strategier. Dessa celler har multipotent förmåga, stor förekomst och regenerativ potential in vivo. Dessutom har de visat förbättrad läkningsförmåga och förbättrade funktionella resultat i djurmodeller1. Icke desto mindre uppvisar dessa celler begränsad förmåga till självförnyelse, fenotypisk mångfald och framför allt begränsad kapacitet för senbildning. Inducerad pluripotent stamcellsteknik (iPSC) erbjuder en lösning på dessa begränsningar på grund av dess anmärkningsvärda självförnyelseförmåga och oöverträffade utvecklingsanpassningsförmåga. Vår forskargrupp och andra har uppnått framgångsrik differentiering av iPSCs till mesenkymala stromacellsliknande enheter (iMSCs)2,3. Som sådan har iMSC potential att vara en allogen källa för sencellsterapiapplikationer.
Scleraxis (SCX) är en transkriptionsfaktor som är nödvändig för senutveckling och anses vara den tidigaste detekterbara markören för differentierade tenocyter. Dessutom aktiverar SCX nedströms sendifferentieringsmarkörer, inklusive kollagen av typ 1a1 (COL1a1), mohawk (MKX) och tenomodulin (TNMD), bland annat 4,5,6. Andra gener som uttrycks under senmognad inkluderar tubulinpolymerisationsfrämjande proteinfamiljemedlem 3 (TPPP3) och trombocythärledd tillväxtfaktorreceptor alfa (PDGFRa)7. Även om dessa gener är viktiga för senutveckling och mognad, är de tyvärr inte unika för senvävnad och uttrycks i andra muskuloskeletala vävnader som ben eller brosk 5,7.
Förutom uttrycket av markörer under senutvecklingen är mekanostimulering ett viktigt element för embryonal senutveckling och läkning 4,5,6. Senor är mekanoresponsiva och deras tillväxtmönster förändras som svar på deras miljö. På molekylär nivå påverkar biomekaniska signaler utvecklingen, mognaden, underhållet och läkningsresponsen hos tenocyter8. Olika bioreaktorsystem har använts för att modellera fysiologiska belastningar och biomekaniska signaler. Några av dessa modellsystem inkluderar ex vivo vävnadsladdning, 2D-cellladdningssystem som applicerar bi-axiell eller enaxlig spänning och 3D-system som använder ställningar och hydrogeler 9,10. 2D-system är fördelaktiga när man studerar den mekaniska stimuleringens effekter på antingen senspecifika gener eller cellernas morfologi i samband med cellens öde, medan 3D-system mer exakt kan replikera cell-ECM-interaktioner 9,10.
I 2D-belastningssystem är belastningen mellan cellerna och odlingssubstratet homogen, vilket innebär att den applicerade belastningen på cellernas cytoskelett kan kontrolleras fullt ut. I jämförelse med tvåaxlig belastning är enaxlig belastning mer fysiologiskt relevant, eftersom tenocyter huvudsakligen utsätts för enaxlig belastning från kollagenbuntar in vivo9. Det har visat sig att senor under dagliga aktiviteter utsätts för enaxlig dragbelastning upp till 6 % belastning11. Specifikt har tidigare studier visat att belastning inom de fysiologiska intervallen på 4%-5% har visat sig främja tenogen differentiering genom att bevara senrelaterat marköruttryck som SCX och TNMD, samt ökad kollagenproduktion 9,10. Stammar på mer än 10 % kan vara traumatiskt relevanta men inte fysiologiskt relevanta12,13.
Här presenteras ett protokoll som tar hänsyn till den synergistiska effekten av mekanisk och biologisk stimulering som kan vara avgörande för generering av tenocyter. Vi beskriver först en reproducerbar metod för att inducera iPSCs i iMSCs via kortvarig exponering av embryoidkroppar för tillväxtfaktorer, bekräftad av MSC-ytmarkörer med hjälp av flödescytometri. Vi beskriver sedan en lentiviral transduktionsmetod för att konstruera iMSCs för att få stabilt överuttryck av SCX (iMSCSCX+). För ytterligare cellmognad sås iMSCSCX+ in i fibronektinbelagda silikonplattor och genomgår ett optimerat enaxligt spänningsprotokoll med hjälp av CellScale MCFX-bioreaktor. Den tenogena potentialen bekräftades genom att observera uppreglering av tidiga och sena senmarkörer, samt kollagendeposition14. Denna metod för att generera iTenocyter är ett proof-of-concept som kan erbjuda en obegränsad lagringsbar, allogen källa för sencellsterapiapplikationer.
I detta protokoll genereras iTenocyter genom tre huvudsteg: (1) induktion av iPSCs till iMSCs, (2) överuttryck av SCX med hjälp av en lentiviral vektor och (3) mognad av celler genom 2D enaxlig spänning.
Protokollet som presenteras för att differentiera iPSC:er till iMSCs har tidigare beskrivits av vår grupp2. Sedan den publiceringen har många protokoll utvecklats, inklusive ett etablerat protokoll för användning av iMSC i kliniska prövningar 21,22,23, samt kom…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes delvis av NIH/NIAMS K01AR071512 och CIRM DISC0-14350 till Dmitriy Sheyn. De två lentivirusförpackningsplasmiderna var en gåva från Simon Knott-laboratoriet (Institutionen för biomedicinska vetenskaper, Cedars-Sinai Medical Center).
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
Accutase | StemCell Technologies | 7920 | cell dissociation reagent |
Antibiotic-antimycotic solution | Thermofisher | 15240096 | |
Anti-CD105 | Ancell | 326-050 | |
APC mouse anti-human CD44 | BD Biosciences | 559942 | |
APC mouse IgG2 K isotype control | BD Biosciences | 555745 | |
BenchMark fetal bovine serum | GeminiBio | 100-106 | |
Biglycan | Thermofisher | Hs00959143_m1 | |
Bovine serum albumin | Millipore Sigma | A3733 | |
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00164004_m1 | |
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer | Thermofisher | Hs00943809_m1 | |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D8418 | |
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermofisher | 11054020 | |
Eagle's minimum essential medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | |
Fibronectin bovine plasma | Sigma Aldrich | F1141 | |
FITC mouse anti-human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma Aldrich | G1890 | |
Goat anti Mouse IgG1-PE | Bio-Rad | STAR117 | |
HEK 293T/17 | ATCC | CRL-11268 | |
IMDM, no phenol red | Thermofisher | 21056023 | |
iPSCs: 83i-cntr-33n1 | Cedars-Sinai iPSC Core Facility | N/A | https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/ |
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC | Miltenyi Biotec | 130-113-271 | |
KnockOut serum replacement | Thermofisher | 10828010 | |
L-ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
L-Glutamine | Thermofisher | 2503081 | |
Matrigel | Corning | 354230 | basement membrane matrix |
MechanoCulture FX | CellScale | N/A | stretching apparatus |
MEM non-essential amino acids solution | Thermofisher | 11140050 | |
Mohawk human Taqman primer | Thermofisher | Hs00543190_m1 | |
mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | |
PBS | Thermofisher | 10010023 | |
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer | Thermofisher | Hs00998018_m1 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) | Sigma Aldrich | 192066 | |
Polybrene infection/transfection reagents | Millipore Sigma | TR-1003 | |
Recombinant human TGF-beta 1 protein human Taqman primer | RnD Systems | 240-B | |
Scleraxis human Taqman primer | Thermofisher | Hs03054634_g1 | |
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone | OriGene | RC224305L4 | |
Silicone plates | CellScale | N/A | |
Sodium azide | Millipore Sigma | S2002 | |
Tenascin C human Taqman primer | Thermofisher | Hs00370384_m1 | |
Tenomodulin human Taqman primer | Thermofisher | Hs00223332_m1 | |
Thrombospondin 4 human Taqman primer | Thermofisher | Hs00170261_m1 | |
Transfection reagent, BioT | Bioland Scientific LLC | B01-01 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermofisher | 25200072 | |
Tubulin polymerization promoting protein family member 3 | Thermofisher | Hs03043892_m1 | |
Y-27632 dihydrochloride | Biogems | 1293823 |