단백질체학 및 인산염체학 분석을 위한 생체 유체에서 세포외 소포체의 화학적 친화성 기반 분리
Summary
본 프로토콜은 기능성 자성 비드를 이용한 요로 세포외 소포체의 효율적인 분리를 위한 상세한 설명을 제공한다. 또한 웨스턴 블로팅(western blotting), 단백질체학(proteomics) 및 포스포프로테오믹스(phosphoproteomics)를 포함한 후속 분석도 포함됩니다.
Abstract
생체액의 세포외 소포체(EV)는 최근 액체 생검 분야에서 상당한 주목을 받고 있습니다. 거의 모든 유형의 세포에서 방출되는 이 세포는 숙주 세포의 실시간 스냅샷을 제공하며 단백질, 특히 세포 기능과 질병 발병 및 진행의 주요 역할을 하는 인산화와 같은 번역 후 변형(PTM)이 있는 단백질을 포함한 풍부한 분자 정보를 포함합니다. 그러나 현재 EV 분리 방법의 낮은 수율과 불순물로 인해 생체 유체에서 EV를 분리하는 것은 여전히 어렵기 때문에 EV 인단백질과 같은 EV 화물의 다운스트림 분석이 어렵습니다. 여기에서는 인간의 소변 및 다운스트림 단백질체학 및 EV 분리 후 인산염체 분석과 같은 생체 유체로부터 EV를 분리하기 위한 기능성 자성 비드를 기반으로 하는 빠르고 효과적인 EV 분리 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 소변 EV의 높은 회수율과 EV 단백질체 및 포스포프로테옴의 민감한 프로파일을 가능하게 했습니다. 또한 이 프로토콜의 다양성과 관련 기술 고려 사항도 여기에서 다룹니다.
Introduction
세포외 소포체(EV)는 모든 유형의 세포에서 분비되는 막에 캡슐화된 나노 입자이며 혈액, 소변, 타액 등과 같은 생체 유체에 존재합니다.1,2,3,4. EV는 숙주 세포의 생리학적 및 병리학적 상태를 반영하는 다양한 생체 활성 분자의 화물을 운반하므로 질병 진행에 중요한 요인으로 기능합니다 4,5,6. 또한, 광범위한 연구를 통해 증상이 시작되거나 종양이 생리적으로 감지되기 전에 EV 기반 질병 마커를 식별할 수 있다는 것이 입증되었습니다 5,6,7.
인산화는 세포 신호 전달 및 조절의 핵심 메커니즘으로 작용합니다. 따라서 인단백질은 비정상적인 인산화 사건이 조절되지 않는 세포 신호 전달 경로 및 암과 같은 전이성 질병 발생과 관련이 있기 때문에 바이오마커 발견을 위한 귀중한 소스를 제공합니다 8,9,10. 인산화 역학을 프로파일링하면 잠재적인 바이오마커로서 질병 특이적 인단백질 시그니처를 식별할 수 있지만, 인단백질의 낮은 존재량과 동적 특성은 인단백질을 바이오마커로 개발하는 데 큰 어려움을 초래합니다11,12. 특히, EV 내에 캡슐화된 저농도 인단백질은 세포외 환경(extracellular environment)에서 외부 효소 분해(external enzymatic digestion)로부터 보호된다 8. 결과적으로, EV 및 EV 유래 인단백질은 암 및 기타 질병의 초기 단계 발견에서 바이오마커 발견을 위한 이상적인 소스를 제공합니다.
EV의 단백질 인산화 분석은 암 신호 전달 및 조기 질병 진단을 이해하는 데 귀중한 리소스를 제공하지만, 효율적인 EV 분리 방법의 부족은 주요 장벽이 됩니다. EV 절연은 일반적으로 차동 초원심분리(DUC)13를 통해 달성됩니다. 그러나 이 방법은 시간이 많이 걸리고 처리량이 적고 재현성이 낮기 때문에 임상적 의미에 적합하지 않습니다13,14. 중합체-유도 침전(polymer-induced precipitation)15과 같은 대안적인 EV 분리 접근법은 비-EV 단백질의 동시 침전으로 인한 낮은 특이성에 의해 제한된다. 항체 기반 친화성 포획(antibody-based affinity capture)16 및 친화성 여과(affinity filtration)17를 포함한 친화성 기반 접근법은 향상된 특이성을 제공하지만, 부피가 작기 때문에 상대적으로 낮은 회수율로 제한됩니다.
EV의 인단백질 역학을 탐구할 때 발생하는 문제를 해결하기 위해 우리 그룹은 기능성 마그네틱 비드에 EV를 포획하기 위한 화학적 친화력을 기반으로 세포외 소포체 전체 회수 및 정제(EVtrap) 기술을 개발했습니다18. 이전 결과는 이 마그네틱 비드 기반 EV 분리 방법이 광범위한 생체 유체 샘플에서 EV를 분리하는 데 매우 효과적이며 DUC 및 기타 기존 분리 방법에 비해 오염을 최소화하면서 훨씬 더 높은 EV 수율을 달성할 수 있음을 입증했습니다18,19. 우리는 다양한 생체 유체에서 파생된 EV의 인산염을 프로파일링하고 다양한 질병에 대한 잠재적인 인단백질 바이오마커를 검출하기 위해 그룹20에서 개발한 EVtrap 및 티타늄 기반 인산펩타이드 농축 방법을 성공적으로 활용했습니다 19,21,22.
여기에서는 순환 EV의 격리를 위한 EVtrap 기반 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 소변 EV에 중점을 둡니다. 또한 웨스턴 블로팅을 사용하여 절연된 EV의 특성화를 시연합니다. 그런 다음 단백질체학 및 인산염체학 분석을 위한 시료 전처리 및 질량분석법(MS) 획득에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 소변 EV 단백질체와 포스포프로테옴을 프로파일링하기 위한 효율적이고 재현 가능한 워크플로우를 제공하며, 이는 EV 및 그 임상 응용 분야에 대한 추가 연구를 용이하게 할 것입니다23.
Protocol
Representative Results
Discussion
효과적인 EV 분리는 EV에서 저농도 단백질과 인단백질을 검출하기 위한 필수 전제 조건입니다. 이러한 요구를 충족시키기 위한 수많은 방법이 개발되었음에도 불구하고 대다수는 여전히 회복 불량 또는 낮은 재현성과 같은 한계로 고통받고 있으며, 이는 대규모 연구 및 일상적인 임상 환경에서 활용을 방해합니다. DUC는 일반적으로 EV 분리를 위한 가장 일반적인 방법으로 간주되며, 추가 세척 단계…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH 보조금 3RF1AG064250 및 R44CA239845의 일부 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
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