Proteomik ve Fosfoproteomik Analizler için Biyoakışkanlardan Hücre Dışı Veziküllerin Kimyasal Afiniteye Dayalı İzolasyonu
Summary
Mevcut protokol, fonksiyonelleştirilmiş manyetik boncuklar kullanılarak idrar hücre dışı veziküllerin etkili izolasyonu için ayrıntılı açıklamalar sağlar. Ayrıca, western blotlama, proteomik ve fosfoproteomik dahil olmak üzere sonraki analizleri kapsar.
Abstract
Biyosıvılardan elde edilen hücre dışı veziküller (EV’ler) son zamanlarda likit biyopsi alanında önemli bir ilgi görmüştür. Hemen hemen her hücre tipi tarafından salınırlar, konakçı hücrelerin gerçek zamanlı bir görüntüsünü sağlarlar ve proteinler, özellikle fosforilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlara (PTM’ler) sahip olanlar da dahil olmak üzere çok sayıda moleküler bilgi içerirler. Bununla birlikte, mevcut EV izolasyon yöntemlerinden kaynaklanan düşük verim ve safsızlıklar nedeniyle EV’lerin biyoakışkanlardan izolasyonu zorlu olmaya devam etmekte ve bu da EV fosfoproteinleri gibi EV kargosunun aşağı akış analizini zorlaştırmaktadır. Burada, insan idrarı gibi biyosıvılardan EV izolasyonu için işlevselleştirilmiş manyetik boncuklara ve aşağı akış proteomiklerine ve EV izolasyonunu takiben fosfoproteomik analize dayalı hızlı ve etkili bir EV izolasyon yöntemini açıklıyoruz. Protokol, idrar EV’lerinin ve EV proteomu ve fosfoproteomunun hassas profillerinin yüksek geri kazanım verimini sağladı. Ayrıca, bu protokolün çok yönlülüğü ve ilgili teknik hususlar da burada ele alınmaktadır.
Introduction
Hücre dışı veziküller (EV’ler), tüm hücre tipleri tarafından salgılanan ve kan, idrar, tükürük vb. biyosıvılarda bulunan zar kapsüllü nanopartiküllerdir.1,2,3,4. EV’ler, konakçı hücrelerinin fizyolojik ve patolojik durumunu yansıtan çeşitli biyoaktif moleküllerden oluşan bir kargo taşır ve bu nedenle hastalığın ilerlemesinde çok önemli faktörler olarak işlev görür 4,5,6. Ayrıca, kapsamlı çalışmalar, EV tabanlı hastalık belirteçlerinin semptomların başlamasından veya tümörlerin fizyolojik tespitinden önce tanımlanabileceğini ortaya koymuştur 5,6,7.
Fosforilasyon, hücresel sinyalleşme ve düzenlemede önemli bir mekanizma görevi görür. Bu nedenle, anormal fosforilasyon olayları, düzensiz hücresel sinyal yolakları ve kansergibi metastatik hastalık gelişimi ile ilişkili olduğundan, fosfoproteinler biyobelirteç keşfi için değerli bir kaynak sağlar 8,9,10. Fosforilasyon dinamiklerinin profillenmesi, hastalığa özgü fosfoprotein imzalarının potansiyel biyobelirteçler olarak tanımlanmasına izin verse de, fosfoproteinlerin düşük bolluğu ve dinamik doğası, fosfoproteinlerin biyobelirteçler olarak geliştirilmesinde büyük zorluklar yaratmaktadır11,12. Özellikle, EV’ler içinde kapsüllenen düşük miktarda fosfoproteinler, hücre dışı ortamda harici enzimatik sindirimden korunur8. Sonuç olarak, EV’ler ve EV’den türetilen fosfoproteinler, kanser ve diğer hastalıkların erken evre tespitinde biyobelirteç keşfi için ideal bir kaynak sunar.
EV’lerde protein fosforilasyonunun analizi, kanser sinyalizasyonunu ve erken evre hastalık teşhisini anlamak için değerli bir kaynak sunsa da, etkili EV izolasyon yöntemlerinin eksikliği büyük bir engel teşkil etmektedir. EV izolasyonu genellikle diferansiyel ultrasantrifüjleme (DUC)13 ile sağlanır. Bununla birlikte, bu yöntem zaman alıcıdır ve düşük verim ve zayıf tekrarlanabilirlik nedeniyle klinik uygulamalar için uygun değildir13,14. Polimer kaynaklı çökeltme15 gibi alternatif EV izolasyon yaklaşımları, EV olmayan proteinlerin birlikte çökelmesi nedeniyle düşük özgüllük ile sınırlıdır. Antikor tabanlı afinite yakalama16 ve afinite filtrasyonu17 dahil olmak üzere afinite tabanlı yaklaşımlar, gelişmiş özgüllük sunar, ancak küçük hacim nedeniyle nispeten düşük bir geri kazanım oranıyla sınırlıdır.
EV’lerde fosfoprotein dinamiklerini keşfetmedeki sorunları ele almak için grubumuz, EV’leri işlevselleştirilmiş manyetik boncuklar18 üzerine yakalamak için kimyasal afiniteye dayalı hücre dışı veziküller toplam geri kazanım ve saflaştırma (EVtrap) tekniği geliştirmiştir. Önceki sonuçlar, bu manyetik boncuk tabanlı EV izolasyon yönteminin, çok çeşitli biyoakışkan numunelerinden EV’leri izole etmede oldukça etkili olduğunu ve DUC ve diğer mevcut izolasyon yöntemlerine kıyasla kontaminasyonu en aza indirirken çok daha yüksek EV verimi elde edebildiğini göstermiştir18,19. Çeşitli biyoakışkanlardan türetilen EV’lerin fosfoproteomunun profilini çıkarmak ve çeşitli hastalıklar için potansiyel fosfoprotein biyobelirteçlerini tespit etmek için EVtrap ve grubumuz20 tarafından geliştirilen titanyum bazlı bir fosfopeptit zenginleştirme yöntemini başarıyla kullandık 19,21,22.
Burada, dolaşımdaki EV’lerin izolasyonu için EVtrap’e dayalı bir protokol sunuyoruz. Protokol idrar EV’lerine odaklanır. Ayrıca, batı lekeleme kullanarak izole edilmiş EV’lerin karakterizasyonunu da gösteriyoruz. Daha sonra hem proteomik hem de fosfoproteomik analizler için numune hazırlama ve kütle spektrometresi (MS) alımını detaylandırıyoruz. Bu protokol, idrar EV proteomu ve fosfoproteomunun profilini çıkarmak için verimli ve tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar, bu da EV’ler ve klinik uygulamaları hakkında daha fazla çalışmayı kolaylaştıracaktır23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etkili EV izolasyonu, EV’lerde düşük miktarda bulunan proteinleri ve fosfoproteinleri tespit etmek için temel bir ön koşuldur. Bu ihtiyacı karşılamak için çok sayıda yöntemin geliştirilmesine rağmen, çoğunluk hala büyük ölçekli çalışmalarda ve rutin klinik ortamlarda kullanımlarını engelleyen zayıf iyileşme veya düşük tekrarlanabilirlik gibi sınırlamalardan muzdariptir. DUC genellikle EV izolasyonu için en yaygın yöntem olarak kabul edilir ve hedef EV’lerin saflığını artırmaya ya…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen NIH hibeleri 3RF1AG064250 ve R44CA239845 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55 (2019).
- van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
- Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
- Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
- Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Harsha, H. C., Pandey, A. Phosphoproteomics in cancer. Mol Oncol. 4 (6), 482-495 (2010).
- Singh, V., et al. Phosphorylation: Implications in Cancer. Protein J. 36 (1), 1-6 (2017).
- Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15 (2006).
- Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics. 9 (6), 1451-1468 (2009).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
- Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
- Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133 (2015).
- Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
- Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
- Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
- Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64 (2023).
- Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536 (2023).
- Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066 (2023).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389 (2021).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
- Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258 (2022).
- Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565 (2023).
- Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232 (2022).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519 (2016).
- Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548 (2020).
- Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279 (2022).
