العزلة القائمة على التقارب الكيميائي للحويصلات خارج الخلية من السوائل الحيوية لتحليل البروتيوميات وعلم الفوسفوبروتيوميكس
Summary
يقدم هذا البروتوكول وصفا مفصلا للعزل الفعال للحويصلات البولية خارج الخلية باستخدام حبات مغناطيسية وظيفية. علاوة على ذلك ، فإنه يشمل التحليلات اللاحقة ، بما في ذلك النشاف الغربي ، والبروتينات ، وعلم الفوسفوبروتيوميكس.
Abstract
اكتسبت الحويصلات خارج الخلية (EVs) من السوائل الحيوية مؤخرا اهتماما كبيرا في مجال الخزعة السائلة. يتم إطلاقها بواسطة كل نوع من الخلايا تقريبا ، وهي توفر لقطة في الوقت الفعلي للخلايا المضيفة وتحتوي على ثروة من المعلومات الجزيئية ، بما في ذلك البروتينات ، ولا سيما تلك التي تحتوي على تعديلات ما بعد الترجمة (PTMs) مثل الفسفرة ، باعتبارها اللاعب الرئيسي للوظائف الخلوية وظهور المرض وتطوره. ومع ذلك ، لا يزال عزل المركبات الكهربائية عن السوائل الحيوية يمثل تحديا بسبب انخفاض الغلة والشوائب من طرق عزل المركبات الكهربائية الحالية ، مما يجعل التحليل النهائي لشحنات المركبات الكهربائية ، مثل البروتينات الفوسفاتية EV ، أمرا صعبا. هنا ، نصف طريقة عزل EV سريعة وفعالة تعتمد على حبات مغناطيسية وظيفية لعزل EV من السوائل الحيوية مثل البول البشري والبروتينات النهائية وتحليل phosphoproteomics بعد عزل EV. مكن البروتوكول من تحقيق عائد استرداد مرتفع من EVs البولية والملامح الحساسة للبروتين EV و phosphoproteome. علاوة على ذلك ، يتم تناول تنوع هذا البروتوكول والاعتبارات التقنية ذات الصلة هنا.
Introduction
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جسيمات نانوية مغلفة بالغشاء تفرزها جميع أنواع الخلايا وهي موجودة في السوائل الحيوية مثل الدم والبول واللعاب وما إلى ذلك 1،2،3،4. تحمل المركبات الكهربائية شحنة من الجزيئات النشطة بيولوجيا المتنوعة التي تعكس الحالة الفسيولوجية والمرضية للخلايا المضيفة ، وبالتالي تعمل كعوامل حاسمة في تطور المرض4،5،6. علاوة على ذلك ، أثبتت الدراسات المكثفة أنه يمكن تحديد علامات المرض القائمة على EV قبل ظهور الأعراض أو الكشف الفسيولوجي عن الأورام5،6،7.
تعمل الفسفرة كآلية رئيسية في الإشارات الخلوية والتنظيم. لذلك ، توفر البروتينات الفوسفاتية مصدرا قيما لاكتشاف العلامات الحيوية حيث ترتبط أحداث الفسفرة الشاذة بمسارات الإشارات الخلوية غير المنظمة وتطور المرض النقيلي مثل السرطان8،9،10. على الرغم من أن ديناميكيات الفسفرة تسمح بتحديد توقيعات البروتين الفوسفاتي الخاصة بالمرض كمؤشرات حيوية محتملة ، إلا أن الوفرة المنخفضة والطبيعة الديناميكية للبروتينات الفوسفاتية تشكل تحديات كبيرة في تطوير البروتينات الفوسفاتية كمؤشرات حيوية11،12. والجدير بالذكر أن البروتينات الفوسفاتية منخفضة الوفرة المغلفة داخل المركبات الكهربائية محمية من الهضم الأنزيمي الخارجي في البيئة خارج الخلية8. وبالتالي ، توفر المركبات الكهربائية والبروتينات الفوسفاتية المشتقة من EV مصدرا مثاليا لاكتشاف العلامات الحيوية في الكشف المبكر عن السرطان والأمراض الأخرى.
على الرغم من أن تحليل فسفرة البروتين في المركبات الكهربائية يوفر موردا قيما لفهم إشارات السرطان وتشخيص المرض في المراحل المبكرة ، إلا أن الافتقار إلى طرق عزل EV الفعالة يمثل عائقا رئيسيا. يتم تحقيق عزل EV بشكل شائع من خلال الطرد المركزي التفاضلي الفائق (DUC) 13. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تستغرق وقتا طويلا وليست مناسبة للآثار السريرية بسبب انخفاض الإنتاجية وضعف التكاثر13,14. طرق عزل EV البديلة ، مثل هطول الأمطار الناجم عن البوليمر15 ، محدودة بسبب الخصوصية المنخفضة بسبب الترسيب المشترك للبروتينات غير EV. توفر الأساليب القائمة على التقارب ، بما في ذلك التقاط التقارب القائم على الأجسام المضادة16 وترشيح التقارب17 ، خصوصية محسنة ولكنها تقتصر على معدل استرداد منخفض نسبيا بسبب الحجم الصغير.
لمعالجة المشكلات المتعلقة باستكشاف ديناميكيات البروتين الفوسفاتي في المركبات الكهربائية ، طورت مجموعتنا تقنية الاسترداد والتنقية الكلية للحويصلات خارج الخلية (EVtrap) بناء على التقارب الكيميائي لالتقاط المركبات الكهربائية على حبات مغناطيسية وظيفية18. أظهرت النتائج السابقة أن طريقة عزل EV القائمة على الخرزة المغناطيسية فعالة للغاية في عزل المركبات الكهربائية من مجموعة واسعة من عينات السوائل الحيوية وقادرة على تحقيق إنتاجية EV أعلى بكثير مع تقليل التلوث مقارنة ب DUC وطرق العزل الأخرى الموجودة18,19. لقد استخدمنا بنجاح EVtrap وطريقة تخصيب الفوسفوببتيد القائمة على التيتانيوم التي طورتها مجموعتنا20 لتحديد ملامح فوسفوبروتيوم المركبات الكهربائية المشتقة من السوائل الحيوية المتنوعة وللكشف عن المؤشرات الحيوية المحتملة للبروتين الفوسفاتي لمختلف الأمراض19،21،22.
هنا ، نقدم بروتوكولا يعتمد على EVtrap لعزل المركبات الكهربائية المتداولة. يركز البروتوكول على المركبات الكهربائية البولية. نوضح أيضا توصيف المركبات الكهربائية المعزولة باستخدام النشاف الغربي. ثم نقوم بتفصيل تحضير العينة واكتساب قياس الطيف الكتلي (MS) لكل من تحليلات البروتينات وعلم الفوسفوبروتيوميكس. يوفر هذا البروتوكول سير عمل فعال وقابل للتكرار لتحديد ملامح بروتين EV البولي و phosphoproteome ، مما سيسهل إجراء مزيد من الدراسات حول EVs وتطبيقاتها السريرية23.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد العزل الفعال للمركبات الكهربائية شرطا أساسيا للكشف عن البروتينات منخفضة الوفرة والبروتينات الفوسفاتية في المركبات الكهربائية. على الرغم من تطوير العديد من الطرق لتلبية هذه الحاجة ، لا تزال الغالبية تعاني من قيود مثل ضعف التعافي أو انخفاض قابلية التكاثر ، مما يعيق استخدامها في الدرا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل جزئيا من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة 3RF1AG064250 و R44CA239845.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
| 1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
| 15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
| Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
| Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
| Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
| EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
| PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
| Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
| timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
| TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
| Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
| Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55 (2019).
- van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
- Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
- Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
- Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
- Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
- Harsha, H. C., Pandey, A. Phosphoproteomics in cancer. Mol Oncol. 4 (6), 482-495 (2010).
- Singh, V., et al. Phosphorylation: Implications in Cancer. Protein J. 36 (1), 1-6 (2017).
- Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15 (2006).
- Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics. 9 (6), 1451-1468 (2009).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
- Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
- Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133 (2015).
- Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
- Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
- Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
- Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64 (2023).
- Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536 (2023).
- Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066 (2023).
- Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389 (2021).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
- Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258 (2022).
- Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565 (2023).
- Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232 (2022).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519 (2016).
- Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548 (2020).
- Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279 (2022).
