توصيل تحت الشبكية لأسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في الفئران RD10
Summary
وصفنا بروتوكولا مفصلا لإعداد الخلايا السلفية للمستقبلات الضوئية المشتقة من hESC المحفوظة بعد التبريد والتوصيل تحت الشبكية لهذه الخلايا في الفئران rd10 .
Abstract
يعد تجديد الخلايا المستقبلة للضوء باستخدام الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات علاجا واعدا لعلاج أمراض الشبكية الوراثية والشيخوخة في المراحل المتقدمة. لقد أظهرنا أن مصفوفة اللامينين المتساوية الشكل الخاصة بشبكية العين البشرية قادرة على دعم تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) إلى أسلاف المستقبلات الضوئية. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر الحقن تحت الشبكية لهذه الخلايا أيضا استعادة جزئية في نماذج القوارض والأرانب rd10 . من المعروف أن الحقن تحت الشبكية هو طريقة راسخة تم استخدامها لتوصيل المركبات الصيدلانية إلى الخلايا المستقبلة للضوء والطبقة الظهارية المصطبغة بالشبكية (RPE) للعين نظرا لقربها من المساحة المستهدفة. كما تم استخدامه لتوصيل النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي إلى الفضاء تحت الشبكية لعلاج أمراض الشبكية. يمثل التوصيل تحت الشبكية للمركبات والخلايا الصيدلانية في نموذج الفئران تحديا بسبب القيود في حجم مقلة عين الفئران. يصف هذا البروتوكول الإجراء التفصيلي لإعداد الخلايا السلفية للمستقبلات الضوئية المشتقة من hESC للحقن وتقنية التوصيل تحت الشبكية لهذه الخلايا في الفئران الطافرة لالتهاب الشبكية الصباغي الوراثي ، rd10 . يسمح هذا النهج بالعلاج الخلوي للمنطقة المستهدفة ، ولا سيما الطبقة النووية الخارجية لشبكية العين ، حيث تحدث الأمراض التي تؤدي إلى تنكس المستقبلات الضوئية.
Introduction
تؤدي أمراض الشبكية الوراثية والتنكس البقعي المرتبط بالعمر إلى فقدان الخلايا المستقبلة للضوء والعمى في نهاية المطاف. المستقبل الضوئي للشبكية هو طبقة الجزء الخارجي من شبكية العين التي تتكون من خلايا متخصصة مسؤولة عن النقل الضوئي (أي تحويل الضوء إلى إشارات عصبية). توجد خلايا مستقبلات الضوء المخروطية والمخروطية بجوار الطبقة المصطبغة في شبكية العين (RPE)1. كان العلاج باستبدال الخلايا المستقبلة للضوء لتعويض فقدان الخلايا نهجا علاجيا ناشئا ومتطورا. تم استخدام الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)2،3،4 ، والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) المشتقة من RPE ، والخلايا السلفية للشبكية (RPCs) 4،5،6،7،8 لاستعادة الخلايا المستقبلة للضوء التالفة. يعد الفضاء تحت الشبكية ، وهو مساحة محصورة بين الشبكية و RPE ، موقعا جذابا لإيداع هذه الخلايا لتحل محل الخلايا المستقبلة للضوء التالفة ، RPE ، وخلايا مولر نظرا لجوارها9،10،11.
تستخدم العلاجات الجينية والخلوية المساحة تحت الشبكية للطب التجديدي لمختلف أمراض الشبكية في الدراسات قبل السريرية. ويشمل ذلك تسليم نسخ وظيفية من أدوات تحرير الجينات أو الجينات في شكل إما علاج قليل النوكليوتيد المضاد للإحساس12،13 أو CRISPR / Cas9 أو تحرير القاعدة عبر الإستراتيجية القائمة على الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAV)14،15،16 ، وزرع المواد (على سبيل المثال ، ورقة RPE ، الأطراف الاصطناعية للشبكية17،18،19) وعضويات الشبكية المتمايزة المشتقة من الخلايا الجذعية20، 21,22 لعلاج أمراض الشبكية والأمراض المرتبطة ب RPE. التجارب السريرية باستخدام hESC-RPE31 في الفضاء تحت الشبكية لعلاج داء ليبر الخلقي المرتبط ب RPE65 (LCA)23,24, أكروماتوبسيا25 المرتبط ب CNGA3, التهاب الشبكية الصباغي26 المرتبط ب MERTK, المشيمية 27,28,29,30 ثبت أنه نهج فعال. الحقن المباشر للخلايا بالقرب من المنطقة المتضررة يحسن بشكل كبير من فرصة استقرار الخلايا في المنطقة المناسبة ، والتكامل المشبكي ، والتحسن البصري في نهاية المطاف.
على الرغم من أن الحقن تحت الشبكية في النماذج البشرية والعيون الكبيرة (أي الخنزير32،33،34،35 ، الأرنب36،37،38،39،40 ، والرئيسيات غير البشرية41،42،43) قد تم تأسيسه ، إلا أن هذا الحقن في نموذج الفئران لا يزال يمثل تحديا بسبب قيود حجم مقلة العين وهائلة. عدسة تحتل عين الفأر44،45،46. ومع ذلك ، فإن النماذج المعدلة وراثيا متاحة بسهولة فقط في الصغيرة وليس في الكبيرة (أي الأرانب والرئيسيات غير البشرية) ، وبالتالي فإن الحقن تحت الشبكية في الفئران يلفت الانتباه إلى التحقيق في الأساليب العلاجية الجديدة في الاضطرابات الوراثية للشبكية. يتم استخدام ثلاثة طرق رئيسية لتوصيل الخلايا أو AAVs إلى الفضاء تحت الشبكية ، وهي الطريق عبر القرنية ، والطريق عبر الصلبة ، وطريق pars plana (انظر الشكل 2). ترتبط الطرق عبر القرنية وعبر الصلبة بتكوين إعتام عدسة العين ، وتزامن ، ونزيف المشيمية ، والارتجاع من موقع الحقن11،44،45،47،48،49. اعتمدنا نهج pars plana كتصور مباشر لعملية الحقن ، ويمكن تحقيق موقع الحقن في الوقت الفعلي تحت المجهر.
لقد وصفنا مؤخرا طريقة يمكنها التمييز بين الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) إلى أسلاف مستقبلات ضوئية في ظل ظروف xenofree ومحددة كيميائيا باستخدام شكل LN523 من الصفيحة البشرية المؤتلف الخاص بشبكية العين. منذ العثور على LN523 ليكون موجودا في شبكية العين ، افترضنا أن مكانة المصفوفة خارج الخلية لشبكية العين البشرية يمكن تلخيصها في المختبر وبالتالي دعم تمايز المستقبلات الضوئية من hESCs36. أظهر تحليل النسخ أحادي الخلية أن أسلاف المستقبلات الضوئية التي تشارك في التعبير عن القضيب المخروطي و recoverin تم إنشاؤها بعد 32 يوما. تم استخدام نموذج فأر متحور تنكس الشبكية 10 (rd10) يحاكي التهاب الشبكية الصباغي البشري الصبغي الجسدي لتقييم فعالية اليوم 32 من أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC في الجسم الحي. تم حقن الخلايا السلفية للمستقبلات الضوئية المشتقة من hESC في الفضاء تحت الشبكية للفئران rd10 في P20 ، حيث يستمر خلل وتنكس المستقبلات الضوئية36. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لإعداد أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC المحفوظة بعد التبريد وتسليمها إلى الفضاء تحت الشبكية للفئران rd10 . يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لإدارة AAVs أو معلقات الخلايا أو الببتيدات أو المواد الكيميائية في الفضاء تحت الشبكية في الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم استخدام الحقن تحت الشبكية لزراعة تعليق الخلايا لعلاج RPE وأمراض الشبكية23،25،26،27،28،31،40. هذا النهج ضروري للغاية في دراسات القوارض ليس فقط لزرع الخلايا ونهج العل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر وي شنغ تان ولوان شيانغ شيويه ين وشيني لي وينغينغ تشونغ على تقديم المساعدة الفنية لإعداد اليوم 32 من أسلاف مستقبلات الضوء المشتقة من hESC بعد الحفظ بالتبريد. تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من جائزة منحة أبحاث الباحثين الشباب التابعة للمجلس الوطني للبحوث الطبية (NMRC / OFYIRG / 0042/2017) ومنحة برنامج البحث التنافسي الرابع والعشرين لمؤسسة البحوث الوطنية (CRP24-2020-0083) إلى H.G.T.
Materials
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
References
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
- Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
- Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
- Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
- Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6 (2016).
- Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362 (2014).
- Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209 (2017).
- Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
- Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53 (2012).
- Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
- Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362 (2015).
- Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
- Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
- Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239 (2019).
- Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34 (2019).
- Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
- Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
- Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585 (2022).
- Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
- McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
- Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34 (2020).
- Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
- Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283 (2013).
- Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
- Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
- Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
- Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
- Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
- Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445 (2022).
- Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
- Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
- Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
- Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
- Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702 (2018).
- Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
- Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
- Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
- Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996 (2018).
- Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
- Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
- Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
- Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
- Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13 (2022).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523 (2015).
- Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717 (2022).
- Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808 (2016).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
