हम पोस्ट-क्रायोप्रेज़र्व्ड एचईएससी-व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर पूर्वज कोशिकाओं की तैयारी और आरडी 10 चूहों में इन कोशिकाओं के उप-रेटिना वितरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं का उपयोग करके फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं का पुनर्जनन उन्नत चरणों में वंशानुगत और उम्र बढ़ने वाले रेटिना रोगों दोनों के उपचार के लिए एक आशाजनक चिकित्सा है। हमने दिखाया है कि मानव पुनः संयोजक रेटिना-विशिष्ट लैमिनिन आइसोफॉर्म मैट्रिक्स फोटोरिसेप्टर पूर्वज के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) के भेदभाव का समर्थन करने में सक्षम है। इसके अलावा, इन कोशिकाओं के उप-रेटिना इंजेक्शन ने आरडी 10 कृंतक और खरगोश मॉडल में आंशिक बहाली भी दिखाई है। उप-रेटिना इंजेक्शन को एक स्थापित विधि के रूप में जाना जाता है जिसका उपयोग फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं और रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियल (आरपीई) परत को दवा यौगिकों को वितरित करने के लिए किया जाता है, जो लक्ष्य स्थान से निकटता के कारण होता है। इसका उपयोग रेटिना रोगों के इलाज के लिए उप-रेटिना अंतरिक्ष में एडेनो-जुड़े वायरल वैक्टर देने के लिए भी किया गया है। murine नेत्रगोलक के आकार में बाधा के कारण murine मॉडल में दवा यौगिकों और कोशिकाओं के उप-रेटिना वितरण चुनौतीपूर्ण है. यह प्रोटोकॉल इंजेक्शन के लिए एचईएससी-व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर पूर्वज कोशिकाओं की तैयारी और आनुवंशिक रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा उत्परिवर्ती, आरडी 10 चूहों में इन कोशिकाओं की उप-रेटिना वितरण तकनीक के लिए विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन करता है। यह दृष्टिकोण सेल थेरेपी को लक्षित क्षेत्र में अनुमति देता है, विशेष रूप से रेटिना की बाहरी परमाणु परत, जहां फोटोरिसेप्टर अध: पतन के लिए अग्रणी बीमारियां होती हैं।
विरासत में मिली रेटिना की बीमारियां और उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन फोटोरिसेप्टर सेल हानि और अंततः अंधापन का कारण बनता है। रेटिना फोटोरिसेप्टर रेटिना की बाहरी खंड परत है जिसमें फोटोट्रांसडक्शन (यानी, न्यूरोनल संकेतों में प्रकाश का रूपांतरण) के लिए जिम्मेदार विशेष कोशिकाएं शामिल हैं। रॉड और शंकु फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं रेटिना रंजित परत (आरपीई)1से सटे हुए हैं। सेल हानि की भरपाई के लिए फोटोरिसेप्टर सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी एक उभरता हुआ और विकासशील चिकित्सीय दृष्टिकोण रहा है। भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी)2,3,4,प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी)-व्युत्पन्न आरपीई कोशिकाओं, और रेटिना पूर्वज कोशिकाओं (आरपीसी)4,5,6,7,8 क्षतिग्रस्त फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं को बहाल करने के लिए इस्तेमाल किया गया. उप-रेटिना अंतरिक्ष, रेटिना और आरपीई के बीच एक सीमित स्थान, क्षतिग्रस्त फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं, आरपीई, और म्यूएलर कोशिकाओं को बदलने के लिए इन कोशिकाओं को जमा करने के लिए एक आकर्षक स्थान है क्योंकि इसके आसपास 9,10,11.
जीन और सेल थेरेपी पूर्व-नैदानिक अध्ययनों में विभिन्न रेटिना रोगों के लिए पुनर्योजी चिकित्सा के लिए उप-रेटिना स्थान का उपयोग कर रहे हैं। इसमें जीन या जीन संपादन उपकरण की कार्यात्मक प्रतियों की डिलीवरी या तो विरोधी भावना ओलिगोन्यूक्लियोटाइड थेरेपी12,13 या सीआरआईएसपीआर/कैस 9 या एडेनो-जुड़े वायरस (एएवी) आधारित रणनीति 14,15,16 के माध्यम से आधार संपादन, सामग्री का आरोपण (जैसे, आरपीई शीट, रेटिना प्रोस्थेटिक्स 17,18,19) और विभेदित स्टेम सेल-व्युत्पन्न रेटिना ऑर्गेनोइड20 के माध्यम से शामिल है, 21,22 रेटिना और आरपीई से संबंधित बीमारियों के इलाज के लिए। RPE31-जुड़े लेबर जन्मजात अमोरोसिस (LCA)23,24, CNGA3-लिंक्ड achromatopsia25, MERTK से जुड़े रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा26, कोरॉइडेरेमिया 27,28,29,30 के इलाज के लिए उप-रेटिना स्पेस में hESC-RPE24 का उपयोग करके नैदानिक परीक्षण एक प्रभावी दृष्टिकोण साबित हुआ है। क्षतिग्रस्त क्षेत्र के आसपास के क्षेत्र में कोशिकाओं का प्रत्यक्ष इंजेक्शन उपयुक्त क्षेत्र, सिनैप्टिक एकीकरण और अंतिम दृश्य सुधार पर सेल निपटान की संभावना में काफी सुधार करता है।
भले ही मानव और बड़ी आंखों वाले मॉडल (यानी, सुअर 32,33,34,35, खरगोश 36,37,38,39,40, और गैर-मानव प्राइमेट 41,42,43) में उप-रेटिना इंजेक्शन स्थापित किया गया है, लेकिन म्यूरिन मॉडल में ऐसा इंजेक्शन अभी भी चुनौतीपूर्ण है नेत्रगोलक आकार और विशाल की विकृति के कारण माउस आंख पर कब्जा करने वाला लेंस44,45,46। हालांकि, आनुवंशिक रूप से संशोधित मॉडल केवल छोटे जानवरों में आसानी से उपलब्ध हैं और बड़े जानवरों (यानी, खरगोश और गैर-मानव प्राइमेट्स) में नहीं, इसलिए चूहों में उप-रेटिना इंजेक्शन रेटिना आनुवंशिक विकारों में उपन्यास चिकित्सीय दृष्टिकोण की जांच करने के लिए ध्यान आकर्षित करता है। कोशिकाओं या एएवी को उप-रेटिना अंतरिक्ष में पहुंचाने के लिए तीन प्रमुख दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा रहा है, अर्थात् ट्रांस-कॉर्नियल मार्ग, ट्रांस-स्क्लरल मार्ग और पार्स प्लाना मार्ग (चित्र 2देखें)। ट्रांस-कॉर्नियल और ट्रांस-स्क्लरल मार्ग इंजेक्शन साइट 11,44,45,47,48,49से मोतियाबिंद गठन, सिनेकिया, कोरॉइडल रक्तस्राव और भाटा से जुड़े हैं। हमने इंजेक्शन प्रक्रिया के प्रत्यक्ष दृश्य के रूप में पार्स प्लाना दृष्टिकोण को अपनाया, और इंजेक्शन साइट को माइक्रोस्कोप के तहत वास्तविक समय में प्राप्त किया जा सकता है।
हमने हाल ही में एक विधि का वर्णन किया है जो मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) को पुनः संयोजक मानव रेटिना-विशिष्ट लैमिनिन आइसोफॉर्म एलएन 523 का उपयोग करके ज़ेनोफ्री, रासायनिक रूप से परिभाषित स्थितियों के तहत फोटोरिसेप्टर पूर्वज में अलग कर सकता है। चूंकि एलएन 523 रेटिना में मौजूद पाया गया था, इसलिए हमने अनुमान लगाया कि मानव रेटिना के बाह्य मैट्रिक्स आला को इन विट्रो में पुन: व्यवस्थित किया जा सकता है और इस तरह एचईएससी36 से फोटोरिसेप्टर भेदभाव का समर्थन किया जा सकता है। एकल-कोशिका ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण से पता चला है कि फोटोरिसेप्टर पूर्वज शंकु-रॉड होमोबॉक्स और रिकवरी को सह-व्यक्त करते हुए 32 दिनों के बाद उत्पन्न हुए थे। एक रेटिना अध: पतन 10 (आरडी 10) उत्परिवर्ती माउस मॉडल है कि autosomal मानव रेटिनाइटिस pigmentosa की नकल दिन 32 hESC व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर progenitors में vivo की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एचईएससी-व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर पूर्वज कोशिकाओं को पी 20 पर आरडी 10 चूहों के उप-रेटिना अंतरिक्ष में इंजेक्ट किया गया था, जहां फोटोसेप्टर शिथिलता और अध: पतन36 चल रहे हैं। यहां, हम पोस्ट-क्रायोप्रेज़र्व्ड एचईएससी-व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर पूर्वज की तैयारी और आरडी 10 चूहों के उप-रेटिना अंतरिक्ष में वितरण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस विधि का उपयोग चूहों में उप-रेटिना अंतरिक्ष में एएवी, सेल निलंबन, पेप्टाइड्स या रसायनों को प्रशासित करने के लिए भी किया जा सकता है।
उप-रेटिना इंजेक्शन का उपयोग आरपीई और रेटिना रोगों 23,25,26,27,28,31,40 के इलाज के लिए सेल निलंबन प्रत्यारोपण के लिए किया गया है।<sup class="xr…
The authors have nothing to disclose.
हम वेई शेंग टैन, लुआन चियांग Xue येन, Xinyi ली, और Yingying चुंग क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद दिन 32 hESC व्युत्पन्न फोटोरिसेप्टर पूर्वज की तैयारी के लिए तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए धन्यवाद. इस काम को नेशनल मेडिकल रिसर्च काउंसिल यंग इन्वेस्टिगेटर रिसर्च ग्रांट अवार्ड (NMRC/OFYIRG/0042/2017) और नेशनल रिसर्च फाउंडेशन 24th कॉम्पिटिटिव रिसर्च प्रोग्राम ग्रांट (CRP24-2020-0083) से H.G.T. को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |