rd10 마우스에서 인간 배아 줄기 세포 유래 광수용체 전구체의 망막하 전달
Summary
동결 보존 후 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조 및 rd10 마우스에서 이러한 세포의 망막하 전달에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
인간 만능 줄기세포를 이용한 광수용체 세포의 재생은 진행된 단계의 유전성 및 노화 망막 질환 치료에 유망한 치료법입니다. 우리는 인간 재조합 망막 특이적 라미닌 동형 매트릭스가 인간 배아 줄기 세포(hESC)에서 광수용체 전구세포로의 분화를 지원할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, 이들 세포의 망막하 주사는 rd10 설치류 및 토끼 모델에서도 부분적인 회복을 보여주었다. 망막하 주사는 표적 공간과의 근접성으로 인해 눈의 광수용체 세포와 망막 색소 상피(RPE)층에 제약 화합물을 전달하는 데 사용되는 확립된 방법으로 알려져 있습니다. 또한 망막 질환을 치료하기 위해 아데노 관련 바이러스 벡터를 망막 하 공간으로 전달하는 데 사용되었습니다. 쥐 모델에서 제약 화합물 및 세포의 망막하 전달은 쥐 안구 크기의 제약으로 인해 어렵습니다. 이 프로토콜은 유전성 망막염 색소성 돌연변이, rd10 마우스에서 주입을 위한 hESC 유래 광수용체 전구 세포의 제조와 이들 세포의 망막하 전달 기술에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 이 접근법은 표적 부위, 특히 광수용체 변성으로 이어지는 질병이 발생하는 망막의 외부 핵층에 대한 세포 치료를 가능하게 합니다.
Introduction
유전성 망막 질환과 노화 관련 황반 변성은 광수용체 세포 손실과 결국 실명으로 이어집니다. 망막 광수용체(retinal photoreceptor)는 광전달(즉, 빛을 신경 신호로 변환)을 담당하는 특수 세포로 구성된 망막의 바깥쪽 분절 층입니다. 간상체와 원추세포 광수용체 세포는 망막 색소층(RPE)에 인접해 있습니다1. 세포 손실을 보상하기 위한 광수용체 세포 대체 요법은 새롭게 발전하고 있는 치료 접근법입니다. 손상된 광수용체 세포를 복원하기 위해 배아 줄기 세포(ESC)2,3,4, 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 RPE 세포 및 망막 전구 세포(RPC)4,5,6,7,8을 사용했습니다. 망막과 RPE 사이의 제한된 공간인 망막하 공간은 손상된 광수용체 세포, RPE 및 Mueller 세포를 대체하기 위해 이러한 세포를 증착하기에 매력적인 위치입니다 9,10,11.
유전자 및 세포 치료제는 전임상 연구에서 다양한 망막 질환에 대한 재생 의학을 위해 망막 하부 공간을 활용하고 있습니다. 여기에는 안티-센스 올리고뉴클레오티드 요법(anti-sense oligonucleotide therapy)12,13 또는 CRISPR/Cas9 또는 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 기반 전략(14,15,16)을 통한 염기 편집(base editing)의 형태로 유전자 또는 유전자 편집 도구의 기능적 사본 전달(functional copy)의 전달이 포함되며, 물질(예: RPE 시트, 망막 보철물 17,18,19) 및 분화된 줄기세포 유래 망막 오가노이드(differentiated stem-cell-derived retinal organoid)20,21,22 망막 및 RPE 관련 질환을 치료합니다. RPE65 관련 Leber 선천성 무뇨증(LCA)23,24, CNGA3 관련 색소 침착증25, MERTK 관련 색소성 망막염26, 맥락막혈증 27,28,29,30을 치료하기 위해 망막하 공간에서 hESC-RPE 31을 사용한 임상 시험 효과적인 접근 방식임이 입증되었습니다. 손상된 부위 부근에 세포를 직접 주입하면 해당 부위에 세포가 정착하고 시냅스가 통합되며 궁극적으로 시력이 개선될 가능성이 크게 향상됩니다.
인간 및 큰 눈을 가진 모델(즉, 돼지 32,33,34,35, 토끼 36,37,38,39,40 및 비인간 영장류 41,42,43)에서 망막하 주사가 확립되었지만, 쥐 모델에서의 이러한 주입은 안구 크기의 제약과 거대함으로 인해 여전히 어렵습니다 마우스 눈(44,45,46)을 차지하는 렌즈. 그러나 유전자 변형 모델은 작은 동물에서만 쉽게 사용할 수 있고 큰 동물(즉, 토끼 및 인간이 아닌 영장류)에서는 쉽게 사용할 수 없기 때문에 마우스의 망막하 주사는 망막 유전 질환에 대한 새로운 치료 접근법을 조사하는 데 주목을 받고 있습니다. 세포 또는 AAV를 망막하 공간으로 전달하기 위해 세 가지 주요 접근 방식, 즉 각막 횡단 경로, 공막 횡단 경로 및 파스 플라나 경로가 사용됩니다(그림 2 참조). 경각막 및 경공막 경로는 백내장 형성, synechiae, 맥락막 출혈 및 주사 부위의 역류와 관련이 있습니다 11,44,45,47,48,49. 우리는 주입 공정의 직접적인 시각화로 pars plana 접근 방식을 채택했으며 현미경으로 실시간으로 주입 부위를 얻을 수 있습니다.
우리는 최근 재조합 인간 망막 특이적 라미닌 동형 LN523을 사용하여 화학적으로 정의된 이종 없는 조건에서 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 광수용체 전구세포로 분화할 수 있는 방법을 설명했습니다. LN523이 망막에 존재하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 우리는 인간 망막의 세포외 기질 틈새가 시험관 내에서 재현될 수 있고, 따라서 hESCs로부터 광수용체 분화를 지원할 수 있다는 가설을 세웠다36. 단세포 전사체 분석 결과, 32일 후 cone-rod homeobox와 recoverin을 함께 발현하는 광수용체 전구세포가 생성되었습니다. 상염색체 인간 색소성 망막염을 모방한 망막 변성 10(rd10) 돌연변이 마우스 모델을 사용하여 생체 내 32 hESC 유래 광수용체 전구체의 효능을 평가했습니다. hESC 유래 광수용체 전구세포를 광수용체 기능 장애 및 퇴화가 진행 중인 P20에서 rd10 마우스의 망막하 공간에 주입하였다36. 여기에서는 동결 후 보존된 hESC 유래 광수용체 전구체의 준비 및 rd10 마우스의 망막하 공간으로의 전달을 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 또한 마우스의 망막하 공간에 AAV, 세포 현탁액, 펩타이드 또는 화학물질을 투여하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
망막하 주사는 RPE 및 망막 질환 23,25,26,27,28,31,40을 치료하기 위한 세포 현탁 이식에 사용되어 왔다. 이 접근법은 세포 이식 및 유전자 치료 접근법뿐만 아니라 망막 질환에 대한 새로운 치료 화합물을 평가하는 설치류 연구…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
동결 보존 후 32 hESC 유래 광수용체 전구체를 준비할 수 있도록 기술적 지원을 제공해 주신 Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee 및 Yingying Chung에게 감사드립니다. 이 연구는 H.G.T.에 대한 National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award(NMRC/OFYIRG/0042/2017) 및 National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant(CRP24-2020-0083)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| 0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| 0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| 0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
| 1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
| 2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
| 24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
| 30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
| Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
| B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
| Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
| Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
| Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
| hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
| Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
| Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
| N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
| PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
| Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
| Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
| Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
| Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
| Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |
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