Sub-retinal leverans av humana embryonala stamcellshärledda fotoreceptorprogenitorer i rd10-möss

Summary

Vi beskriver ett detaljerat protokoll för framställning av post-kryokonserverade hESC-härledda fotoreceptorprogenitorceller och subretinal leverans av dessa celler i rd10-möss .

Abstract

Regenerering av fotoreceptorceller med hjälp av humana pluripotenta stamceller är en lovande terapi för behandling av både ärftliga och åldrande näthinnesjukdomar i avancerade stadier. Vi har visat att human rekombinant retina-specifik lamininisoformmatris kan stödja differentieringen av humana embryonala stamceller (hESC) till fotoreceptorprogenitorer. Dessutom har subretinal injektion av dessa celler också visat partiell återställning i rd10-gnagar – och kaninmodellerna. Subretinal injektion är känd för att vara en etablerad metod som har använts för att leverera farmaceutiska föreningar till fotoreceptorcellerna och retinal pigmenterad epitel (RPE) i ögat på grund av dess närhet till målutrymmet. Det har också använts för att leverera adeno-associerade virala vektorer till det subretinala utrymmet för att behandla näthinnesjukdomar. Den subretinala leveransen av farmaceutiska föreningar och celler i den murina modellen är utmanande på grund av begränsningen i storleken på den murina ögongloben. Detta protokoll beskriver den detaljerade proceduren för beredning av hESC-härledda fotoreceptorstamceller för injektion och subretinal leveransteknik för dessa celler i genetisk retinitis pigmentosa-mutant, rd10-möss . Detta tillvägagångssätt möjliggör cellterapi till målområdet, i synnerhet det yttre kärnskiktet i näthinnan, där sjukdomar som leder till fotoreceptordegeneration uppstår.

Introduction

Ärftliga näthinnesjukdomar och åldersrelaterad makuladegeneration leder till förlust av fotoreceptorceller och slutligen blindhet. Den retinala fotoreceptorn är det yttre segmentskiktet av näthinnan som består av specialiserade celler som ansvarar för fototransduktion (dvs. omvandling av ljus till neuronala signaler). Stav- och tappfotoreceptorcellerna ligger intill det retinala pigmenterade skiktet (RPE)¹. Ersättningsterapi med fotoreceptorceller för att kompensera cellförlusten har varit ett framväxande och utvecklande terapeutiskt tillvägagångssätt. Embryonala stamceller (ESC)^2,3,4, inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs)-härledda RPE-celler och retinala stamceller (RPC)^4,5,6,7,8 användes för att återställa de skadade fotoreceptorcellerna. Subretinalt utrymme, ett begränsat utrymme mellan näthinnan och RPE, är en attraktiv plats för att deponera dessa celler för att ersätta skadade fotoreceptorceller, RPE och Mueller-celler på grund av dess närhet ^9,10,11.

Gen- och cellterapier har utnyttjat det subretinala utrymmet för regenerativ medicin för olika näthinnesjukdomar i prekliniska studier. Detta inkluderar leverans av funktionella kopior av gen- eller genredigeringsverktygen i form av antingen antisensoligonukleotidterapi^12,13 eller CRISPR/Cas9 eller basredigering via adenoassocierat virus (AAV) baserad strategi 14,15,16, implantation av material (t.ex. RPE-ark, näthinneproteser 17,18,19) och differentierade stamcellsderiverade retinala organoider ^20,21,22 för att behandla näthinne- och RPE-relaterade sjukdomar. Kliniska prövningar med hESC-RPE³¹ i subretinalt utrymme för att behandla RPE65-associerad Leber kongenital amauros (LCA)^23,24, CNGA3-kopplad akromatopsi²⁵, MERTK-associerad retinitis pigmentosa²⁶, choroiderema 27,28,29,30 har visat sig vara ett effektivt tillvägagångssätt. Direkt injektion av celler i närheten av det skadade området förbättrar avsevärt chansen för cellsättning i lämplig region, synaptisk integration och eventuell visuell förbättring.

Även om subretinal injektion i mänskliga och storögda modeller (dvs. gris 32,33,34,35, kanin 36,37,38,39,40 och icke-mänsklig primat 41,42,43) har fastställts, är sådan injektion i den murina modellen fortfarande utmanande på grund av begränsningen av ögonglobens storlek och enorma lins som upptar musögat 44,45,46. Genetiskt modifierade modeller är dock endast lätt tillgängliga hos små djur och inte hos stora djur (dvs. kaniner och icke-mänskliga primater), därför uppmärksammar subretinal injektion i möss att undersöka nya terapeutiska metoder vid retinala genetiska sjukdomar. Tre huvudsakliga tillvägagångssätt används för att leverera celler eller AAV till det subretinala utrymmet, nämligen transhornhinnan, transskleral väg och pars plana-vägen (se figur 2). Hornhinne- och transsklerala vägar är förknippade med kataraktbildning, synechier, koroidal blödning och reflux från injektionsstället 11,44,45,47,48,49. Vi antog pars plana-metoden som en direkt visualisering av injektionsprocessen, och injektionsstället kan uppnås i realtid under mikroskopet.

Vi beskrev nyligen en metod som kan differentiera humana embryonala stamceller (hESC) till fotoreceptorprogenitorer under xenofria, kemiskt definierade förhållanden med hjälp av rekombinant human retina-specifik lamininisoform LN523. Eftersom LN523 visade sig finnas i näthinnan, antog vi att den extracellulära matrixnischen i den mänskliga näthinnan kunde rekapituleras in vitro och därmed stödja fotoreceptordifferentiering från hESCs³⁶. Transkriptomisk analys av enskilda celler visade att fotoreceptorprogenitorer som samuttrycker kon-stav, homeobox och recoverin genererades efter 32 dagar. En retinal degeneration 10 (rd10) mutant musmodell som efterliknar autosomal human retinitis pigmentosa användes för att utvärdera effekten av dag 32 hESC-härledda fotoreceptorstamceller in vivo. De hESC-härledda fotoreceptorstamcellerna injicerades i det subretinala utrymmet hos rd10-möss vid P20, där fotoceptordysfunktion och degeneration pågår³⁶. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för beredning av de post-kryokonserverade hESC-härledda fotoreceptorprogenitorerna och leverans till det subretinala utrymmet hos rd10-möss . Denna metod kan också användas för att administrera AAV, cellsuspensioner, peptider eller kemikalier i det subretinala utrymmet hos möss.

Protocol

In vivo-experimenten utfördes i enlighet med de riktlinjer och protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) och Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the use of animals in Ophthalmic and Vision Research. Ungarna immunsupprimerades från P17 (före transplantation) till P30 (efter transplantation) genom att ge dem dricksvatten innehållande ciklosporin (260 g/l). 1. Beredning av dag 32 hESC-härl…

Representative Results

Glassprutan på 10 μl monterades enligt tillverkarens anvisningar (figur 1) och den trubbiga nål som användes för att mata cellsuspensionen/mediet visas i figur 1B. Olika tillvägagångssätt för subretinal injektion illustreras i figur 2. Vi beskriver pars plana-metoden i detta protokoll (figur 2C). Den trubbiga nålen monterad på en glasspruta fördes in genom ett sklerotomisår och kom åt det …

Discussion

Den subretinala injektionen har använts för cellsuspensionstransplantation för att behandla RPE och näthinnesjukdomar 23,25,26,27,28,31,40. Detta tillvägagångssätt är mycket viktigt i gnagarstudier, inte bara för celltransplantation och genterapi, utan också för att utvärdera nya…

Materials

0.3% Tobramycin	Novartis	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone	Novartis	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe	Turemo	SS01T2713
1% Tropicamide	Alcon	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate	Costar	3526
30 G Disposable needle	Becton Dickinson (BD)	305128
33 G, 20 mm length blunt needles	Hamilton	7803-05
Automated Cell Counter	NanoEnTek	Model: Eve
B27 without Vitamin A	Life Technologies	12587001	2%36
Buprenorphine	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
Cyclosporine	Novartis		260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells	DUKE-NUS Medical School		Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium	Gibco	11710–035
hESC cell line H1	WiCell Research Institute	WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
Microlitre glass syringe (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 supplement	Life Technologies	A13707-01	1%36
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF Media	Satorius	05-100-1A
Operating microscope	Zeiss	OPMI LUMERA 700	With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)	DUKE-NUS Medical School		See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 mice	Jackson Laboratory	B6.CXB1-Pde6brd10/J mice	Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g
Retinoic acid	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)	Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36