Sub-retinal levering av humane embryonale stamcelleavledede fotoreceptorprogenitorer i rd10 mus

Summary

Vi beskriver en detaljert protokoll for fremstilling av postkryopreserverte hESC-avledede fotoreceptor-stamceller og subretinal levering av disse cellene i rd10-mus .

Abstract

Regenerering av fotoreceptorceller ved bruk av humane pluripotente stamceller er en lovende terapi for behandling av både arvelige og aldrende retinale sykdommer i avanserte stadier. Vi har vist at human rekombinant retina-spesifikk lamininisoformmatrise er i stand til å støtte differensiering av humane embryonale stamceller (hESCs) til fotoreceptorprogenitorer. I tillegg har subretinal injeksjon av disse cellene også vist delvis restaurering i rd10 gnager- og kaninmodellene. Sub-retinal injeksjon er kjent for å være en etablert metode som har blitt brukt til å levere farmasøytiske forbindelser til fotoreceptorcellene og retinalpigmentert epitel (RPE) lag av øyet på grunn av sin nærhet til målrommet. Det har også blitt brukt til å levere adeno-assosierte virale vektorer inn i sub-retinal plass for å behandle retinal sykdommer. Subretinal tilførsel av farmasøytiske forbindelser og celler i murine modellen er utfordrende på grunn av begrensningen i størrelsen på murine eyeball. Denne protokollen beskriver den detaljerte prosedyren for fremstilling av hESC-avledede fotoreceptorstamceller til injeksjon og subretinal leveringsteknikk for disse cellene i genetisk retinitis pigmentosa mutant, rd10 mus. Denne tilnærmingen tillater celleterapi til det målrettede området, spesielt det ytre nukleære laget av netthinnen, hvor sykdommer som fører til fotoreceptordegenerasjon forekommer.

Introduction

Arvelige retinale sykdommer og aldersrelatert makuladegenerasjon fører til fotoreceptorcelletap og eventuell blindhet. Retinal fotoreceptor er det ytre segmentlaget av netthinnen som består av spesialiserte celler som er ansvarlige for fototransduksjon (dvs. konvertering av lys til nevronsignaler). Stav- og kjeglefotoreseptorcellene ligger ved siden av retinalpigmentlaget (RPE)¹. Fotoreceptorcelleutskiftningsterapi for å kompensere celletapet har vært en fremvoksende og utviklende terapeutisk tilnærming. Embryonale stamceller (ESC)^2,3,4, induserte pluripotente stamceller (iPSCs)-avledede RPE-celler og retinale stamceller (RPCer)^4,5,6,7,8 ble brukt til å gjenopprette de skadede fotoreseptorcellene. Sub-retinal plass, et begrenset rom mellom retina og RPE, er et attraktivt sted å deponere disse cellene for å erstatte skadede fotoreceptorceller, RPE og Mueller-celler på grunn av sin nærhet ^9,10,11.

Gen- og celleterapier har utnyttet det sub-retinale rommet for regenerativ medisin for ulike retinale sykdommer i prekliniske studier. Dette inkluderer levering av funksjonelle kopier av genet eller genredigeringsverktøyene i form av enten anti-sense oligonukleotidterapi^12,13 eller CRISPR/Cas9 eller baseredigering via adenoassosiert virus (AAV) basert strategi 14,15,16, implantasjon av materialer (f.eks. RPE-ark, retinalprotetikk 17,18,19) og differensierte stamcelleavledede retinale organoider ^20,21,22 for å behandle retinale og RPE-relaterte sykdommer. Kliniske studier ved bruk av hESC-RPE³¹ i subretinalrommet for å behandle RPE65-assosiert Leber medfødt amaurose (LCA)^23,24, CNGA3-bundet achromatopsia²⁵, MERTK-assosiert retinitis pigmentosa²⁶, koroideremi 27,28,29,30 har vist seg å være en effektiv tilnærming. Direkte injeksjon av celler i nærheten av det skadede området forbedrer sjansen for celleoppgjør i riktig region, synaptisk integrasjon og eventuell visuell forbedring.

Selv om sub-retinal injeksjon i humane og storøyde modeller (dvs. gris 32,33,34,35, kanin 36,37,38,39,40 og ikke-menneskelig primat 41,42,43) er etablert, er slik injeksjon i murinmodellen fortsatt utfordrende på grunn av begrensningen av øyebollstørrelsen og enorm linse som opptar museøyet 44,45,46. Imidlertid er genetisk modifiserte modeller bare lett tilgjengelige hos små dyr og ikke hos store dyr (dvs. kaniner og ikke-menneskelige primater), derfor trekker subretinal injeksjon hos mus oppmerksomhet for å undersøke nye terapeutiske tilnærminger i retinale genetiske lidelser. Tre hovedtilnærminger brukes til å levere celler eller AAVer inn i subretinalrommet, nemlig transhornhinnen, transskleral rute og pars plana-ruten (se figur 2). Trans-hornhinne og transsklerale ruter er assosiert med kataraktdannelse, synechiae, choroidal blødning og refluks fra injeksjonsstedet 11,44,45,47,48,49. Vi vedtok pars plana-tilnærmingen som en direkte visualisering av injeksjonsprosessen, og injeksjonsstedet kan oppnås i sanntid under mikroskopet.

Vi har nylig beskrevet en metode som kan skille humane embryonale stamceller (hESCs) til fotoreceptorprogenitorer under xenofrie, kjemisk definerte forhold ved bruk av rekombinant humant retina-spesifikt lamininisoform LN523. Siden LN523 ble funnet å være tilstede i netthinnen, antydet vi at den ekstracellulære matriksnisjen i den humane netthinnen kunne rekapituleres in vitro og dermed støtte fotoreseptordifferensiering fra hESCs³⁶. Enkeltcelle transkriptomisk analyse viste at fotoreceptorprogenitorer som samtidig uttrykker kjeglestavhomøoboks og recoverin ble generert etter 32 dager. En retinal degenerasjon 10 (rd10) mutant musemodell som etterligner autosomal human retinitis pigmentosa ble brukt til å evaluere effekten av dagens 32 hESC-avledede fotoreceptorprogenitorer in vivo. De hESC-avledede fotoreceptorprogenitorcellene ble injisert i subretinalrommet til rd10-mus ved P20, hvor fotoceptordysfunksjon og degenerasjon pågår³⁶. Her beskriver vi en detaljert protokoll for fremstilling av postkryopreserverte hESC-avledede fotoreceptorprogenitorer og levering i sub-retinalrommet til rd10-mus . Denne metoden kan også brukes til å administrere AAV, cellesuspensjoner, peptider eller kjemikalier inn i subretinalrommet hos mus.

Protocol

In vivo-eksperimentene ble gjort i samsvar med retningslinjene og protokollen godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) og Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for bruk av dyr i oftalmisk og synsforskning. Valpene ble immunsupprimert fra P17 (pretransplantasjon) til P30 (etter transplantasjon) ved å gi dem drikkevann som inneholdt ciklosporin (260 g/L). 1. Tilberedning av dag 32 hESC-avledede fotoreseptorproge…

Representative Results

10 μL glasssprøyten ble montert i henhold til produsentens instruksjoner (figur 1), og den butte nålen som ble brukt til å tilføre cellesuspensjonen/mediet er vist i figur 1B. Ulike tilnærminger til subretinal injeksjon er illustrert i figur 2. Vi beskriver pars plana-tilnærmingen i denne protokollen (figur 2C). Den stumpe nålen montert på en glasssprøyte ble satt inn gjennom et sklerotomi så…

Discussion

Den sub-retinale injeksjonen har blitt brukt til cellesuspensjonstransplantasjon for å behandle RPE og retinale sykdommer 23,25,26,27,28,31,40. Denne tilnærmingen er svært viktig i gnagerstudier, ikke bare for celletransplantasjon og genterapitilnærminger, men også for å evaluere nye t…

Materials

0.3% Tobramycin	Novartis	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone	Novartis	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe	Turemo	SS01T2713
1% Tropicamide	Alcon	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate	Costar	3526
30 G Disposable needle	Becton Dickinson (BD)	305128
33 G, 20 mm length blunt needles	Hamilton	7803-05
Automated Cell Counter	NanoEnTek	Model: Eve
B27 without Vitamin A	Life Technologies	12587001	2%36
Buprenorphine	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
Cyclosporine	Novartis		260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells	DUKE-NUS Medical School		Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium	Gibco	11710–035
hESC cell line H1	WiCell Research Institute	WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
Microlitre glass syringe (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 supplement	Life Technologies	A13707-01	1%36
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF Media	Satorius	05-100-1A
Operating microscope	Zeiss	OPMI LUMERA 700	With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)	DUKE-NUS Medical School		See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 mice	Jackson Laboratory	B6.CXB1-Pde6brd10/J mice	Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g
Retinoic acid	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)	Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36