Субретинальная доставка фоторецепторов-предшественников эмбриональных стволовых клеток человека у мышей RD10

Summary

Описан подробный протокол подготовки посткриоконсервированных клеток-предшественников фоторецепторов hESC и субретинальной доставки этих клеток у мышей rd10 .

Abstract

Регенерация фоторецепторных клеток с помощью плюрипотентных стволовых клеток человека является перспективной терапией для лечения как наследственных, так и возрастных заболеваний сетчатки на поздних стадиях. Мы показали, что человеческий рекомбинантный матрица изоформы ламинина, специфичная для сетчатки, способна поддерживать дифференцировку эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) в прогениторы фоторецепторов. Кроме того, субретинальная инъекция этих клеток также показала частичное восстановление на моделях грызунов и кроликов rd10 . Субретинальная инъекция, как известно, является признанным методом, который используется для доставки фармацевтических соединений в фоторецепторные клетки и слой пигментного эпителия сетчатки (RPE) глаза из-за его близости к целевому пространству. Он также используется для доставки аденоассоциированных вирусных векторов в субретинальное пространство для лечения заболеваний сетчатки. Субретинальная доставка фармацевтических соединений и клеток в мышиной модели затруднена из-за ограничений в размере мышиного глазного яблока. В этом протоколе подробно описана процедура подготовки клеток-предшественников фоторецепторов, полученных из hESC, для инъекции и методика субретинальной доставки этих клеток у мышей с мутацией генетического пигментного ретинита, rd10 . Такой подход позволяет проводить клеточную терапию в целевой области, в частности во внешнем ядерном слое сетчатки, где происходят заболевания, приводящие к дегенерации фоторецепторов.

Introduction

Наследственные заболевания сетчатки и возрастная макулярная дегенерация приводят к потере фоторецепторных клеток и, в конечном итоге, к слепоте. Фоторецептор сетчатки представляет собой наружный сегментный слой сетчатки, состоящий из специализированных клеток, ответственных за фототрансдукцию (т.е. преобразование света в нейронные сигналы). Палочковидные и колбочковые фоторецепторные клетки примыкают к пигментному слою сетчатки (РПЭ)¹. Заместительная терапия фоторецепторными клетками для компенсации потери клеток является новым и развивающимся терапевтическим подходом. Для восстановления поврежденных фоторецепторных клеток использовали эмбриональные стволовые клетки (ЭСК)^2,3,4, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), полученные из РПЭ, и клетки-предшественники сетчатки (РПК)^4,5,6,7,8. Субретинальное пространство, ограниченное пространство между сетчаткой и РПЭ, является привлекательным местом для депонирования этих клеток для замены поврежденных фоторецепторных клеток, РПЭ и клеток Мюллера из-за его близости ^9,10,11.

Генная и клеточная терапия использует субретинальное пространство для регенеративной медицины при различных заболеваниях сетчатки в доклинических исследованиях. Это включает в себя доставку функциональных копий гена или инструментов редактирования генов в форме антисмысловой олигонуклеотидной терапии^12,13 или CRISPR/Cas9 или редактирования оснований с помощью стратегии 14,15,16, основанной на аденоассоциированном вирусе (AAV), имплантацию материалов (например, листа RPE, протезирования сетчатки 17,18,19) и дифференцированных органоидов сетчатки, полученных из стволовых клеток ^20,21,22 для лечения заболеваний сетчатки и РПЭ. Клинические исследования с использованием hESC-RPE³¹ в субретинальном пространстве для лечения врожденного амавроза Лебера, ассоциированного с RPE65 (LCA)^23,24, CNGA3-ассоциированной ахроматопсии²⁵, MERTK-ассоциированного пигментного ретинита²⁶, хороидеремии 27,28,29,30 доказали свою эффективность. Прямое введение клеток в окрестности поврежденного участка значительно повышает вероятность заселения клеток в соответствующей области, синаптической интеграции и, в конечном итоге, улучшения зрения.

Несмотря на то, что субретинальная инъекция в моделях человека и большеглазых животных (т.е. свиньи 32,33,34,35, кролика 36,37,38,39,40 и нечеловекообразного примата 41,42,43) была установлена, такая инъекция в мышиной модели все еще является сложной задачей из-за ограниченного размера глазного яблока и огромных размеров линза, занимающая глаз мыши 44,45,46. Тем не менее, генетически модифицированные модели легко доступны только для мелких животных, а не для крупных животных (т.е. кроликов и нечеловекообразных приматов), поэтому субретинальная инъекция мышам привлекает внимание к исследованию новых терапевтических подходов к генетическим заболеваниям сетчатки. Для доставки клеток или AAV в субретинальное пространство используются три основных подхода, а именно трансроговичный путь, транссклеральный путь и pars plana (см. рис. 2). Трансроговичный и транссклеральный пути связаны с образованием катаракты, синехий, хориоидейальных кровотечений и рефлюкса из места инъекции 11,44,45,47,48,49. Мы приняли подход pars plana в качестве прямой визуализации процесса инъекции, и место инъекции может быть достигнуто в режиме реального времени под микроскопом.

Недавно мы описали метод, который может дифференцировать человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭСК) в фоторецепторы-предшественники в ксеносвободных, химически определенных условиях с использованием рекомбинантной изоформы ламинина LN523, специфичной для сетчатки человека. Поскольку было обнаружено, что LN523 присутствует в сетчатке, мы предположили, что ниша внеклеточного матрикса сетчатки человека может быть рекапитулирована in vitro и тем самым поддерживать дифференцировку фоторецепторов от чЭСК³⁶. Одноклеточный транскриптомный анализ показал, что предшественники фоторецепторов, совместно экспрессирующие конусно-палочковый гомеобокс и рекремен, генерировались через 32 дня. Модель мутантной мыши с дегенерацией сетчатки 10 (rd10), которая имитирует пигментный аутосомный ретинит человека, была использована для оценки эффективности фоторецепторов-предшественников in vivo на 32-й день hESC. Клетки-предшественники фоторецепторов, полученные из hESC, были введены в субретинальное пространство мышей rd10 на P20, где продолжается дисфункция и дегенерация фоторецептора³⁶. В данной статье мы опишем подробный протокол подготовки посткриоконсервированных фоторецепторов-предшественников hESC и их доставки в субретинальное пространство мышей rd10 . Этот метод также может быть использован для введения AAV, клеточных суспензий, пептидов или химических веществ в субретинальное пространство у мышей.

Protocol

Эксперименты in vivo проводились в соответствии с руководящими принципами и протоколом, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных SingHealth (IACUC) и Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических и…

Representative Results

Стеклянный шприц объемом 10 мкл был собран в соответствии с инструкциями производителя (рис. 1), а тупая игла, используемая для подачи клеточной суспензии/среды, показана на рисунке 1B. Различные подходы к субретинальной инъекции проиллюстрированы на <strong cl…

Discussion

Субретинальная инъекция была использована для трансплантации клеточной суспензии для лечения РПЭ и заболеваний сетчатки 23,25,26,27,28,31,40. Этот подход очень важен …

Materials

0.3% Tobramycin	Novartis	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone	Novartis	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe	Turemo	SS01T2713
1% Tropicamide	Alcon	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate	Costar	3526
30 G Disposable needle	Becton Dickinson (BD)	305128
33 G, 20 mm length blunt needles	Hamilton	7803-05
Automated Cell Counter	NanoEnTek	Model: Eve
B27 without Vitamin A	Life Technologies	12587001	2%36
Buprenorphine	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
Cyclosporine	Novartis		260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells	DUKE-NUS Medical School		Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium	Gibco	11710–035
hESC cell line H1	WiCell Research Institute	WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
Microlitre glass syringe (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 supplement	Life Technologies	A13707-01	1%36
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF Media	Satorius	05-100-1A
Operating microscope	Zeiss	OPMI LUMERA 700	With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)	DUKE-NUS Medical School		See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 mice	Jackson Laboratory	B6.CXB1-Pde6brd10/J mice	Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g
Retinoic acid	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)	Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36