Vi beskriver en detaljeret protokol til fremstilling af postkryopræserverede hESC-afledte fotoreceptorstamceller og subretinal levering af disse celler i rd10-mus .
Regenerering af fotoreceptorceller ved hjælp af humane pluripotente stamceller er en lovende terapi til behandling af både arvelige og aldrende nethindesygdomme på avancerede stadier. Vi har vist, at human rekombinant nethindespecifik laminin isoform matrix er i stand til at understøtte differentieringen af humane embryonale stamceller (hESC’er) til fotoreceptorforfædre. Derudover har subretinal injektion af disse celler også vist delvis restaurering i rd10 gnaver- og kaninmodellerne. Subretinal injektion er kendt for at være en etableret metode, der er blevet brugt til at levere farmaceutiske forbindelser til fotoreceptorcellerne og retinal pigmenteret epitel (RPE) lag i øjet på grund af dets nærhed til målrummet. Det er også blevet brugt til at levere adeno-associerede virale vektorer i sub-retinale rum til behandling af retinale sygdomme. Den subretinale levering af farmaceutiske forbindelser og celler i murine modellen er udfordrende på grund af begrænsningen i størrelsen af murine øjeæblet. Denne protokol beskriver den detaljerede procedure til fremstilling af hESC-afledte fotoreceptorstamceller til injektion og subretinal leveringsteknik for disse celler i genetisk retinitis pigmentosa-mutant, rd10-mus . Denne tilgang tillader celleterapi til det målrettede område, især det ydre nukleare lag af nethinden, hvor sygdomme, der fører til fotoreceptordegeneration, forekommer.
Arvelige retinale sygdomme og aldersrelateret makuladegeneration fører til fotoreceptorcelletab og eventuel blindhed. Den retinale fotoreceptor er det ydre segmentlag af nethinden, der består af specialiserede celler, der er ansvarlige for fototransduktion (dvs. omdannelse af lys til neuronale signaler). Stang- og keglefotoreceptorcellerne støder op til det retinale pigmenterede lag (RPE)1. Fotoreceptorcellesubstitutionsterapi for at kompensere for celletabet har været en ny og udviklende terapeutisk tilgang. Embryonale stamceller (ESC’er)2,3,4, inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er)-afledte RPE-celler og retinale stamceller (RPC’er)4,5,6,7,8 blev brugt til at gendanne de beskadigede fotoreceptorceller. Sub-retinal rum, et begrænset rum mellem nethinden og RPE, er et attraktivt sted at deponere disse celler for at erstatte beskadigede fotoreceptorceller, RPE og Mueller-celler på grund af dets nærhed 9,10,11.
Gen- og celleterapier har udnyttet det subretinale rum til regenerativ medicin til forskellige nethindesygdomme i prækliniske undersøgelser. Dette omfatter levering af funktionelle kopier af genet eller genredigeringsværktøjer i form af enten anti-sense oligonukleotidterapi12,13 eller CRISPR/Cas9 eller baseredigering via adeno-associeret virus (AAV) baseret strategi 14,15,16, implantation af materialer (f.eks. RPE-ark, retinale proteser 17,18,19) og differentierede stamcelleafledte retinale organoider 20,21,22 til behandling af retinale og RPE-relaterede sygdomme. Kliniske forsøg med hESC-RPE31 i subretinale rum til behandling af RPE65-associeret Leber medfødt amaurose (LCA)23,24, CNGA3-bundet achromatopsi25, MERTK-associeret retinitis pigmentosa26, choroideræmi 27,28,29,30 har vist sig at være en effektiv tilgang. Direkte injektion af celler i nærheden af det beskadigede område forbedrer i høj grad chancen for celleafvikling i det passende område, synaptisk integration og eventuel visuel forbedring.
Selvom subretinal injektion i humane og storøjede modeller (dvs. svin 32,33,34,35, kanin 36,37,38,39,40 og ikke-menneskelig primat 41,42,43) er blevet etableret, er en sådan injektion i murinmodellen stadig udfordrende på grund af begrænsningen af øjeæblestørrelsen og den enorme linse, der optager museøjet 44,45,46. Imidlertid er genetisk modificerede modeller kun let tilgængelige i små dyr og ikke i store dyr (dvs. kaniner og ikke-menneskelige primater), og derfor henleder subretinal injektion i mus opmærksomheden på at undersøge nye terapeutiske tilgange til retinale genetiske lidelser. Tre hovedmetoder bruges til at levere celler eller AAV’er ind i det subretinale rum, nemlig den trans-hornhindevej, trans-scleral rute og pars plana-ruten (se figur 2). Transhornhinde og transsklerale veje er forbundet med dannelse af grå stær, synekkier, choroidal blødning og tilbagesvaling fra injektionsstedet 11,44,45,47,48,49. Vi vedtog pars plana-tilgangen som en direkte visualisering af injektionsprocessen, og injektionsstedet kan opnås i realtid under mikroskopet.
Vi beskrev for nylig en metode, der kan differentiere humane embryonale stamceller (hESC’er) til fotoreceptorforfædre under xenofree, kemisk definerede betingelser ved hjælp af rekombinant human retina-specifik lamininisoform LN523. Da LN523 viste sig at være til stede i nethinden, antog vi, at den ekstracellulære matrixniche i den menneskelige nethinde kunne rekapituleres in vitro og derved understøtte fotoreceptordifferentiering fra hESC’erne36. Enkeltcelle transkriptomisk analyse viste, at fotoreceptorprogenitorer, der co-udtrykker keglestang, homeobox og recoverin, blev genereret efter 32 dage. En retinal degeneration 10 (rd10) mutant musemodel, der efterligner autosomal human retinitis pigmentosa, blev brugt til at evaluere effekten af dag 32 hESC-afledte fotoreceptorforfædre in vivo. De hESC-afledte fotoreceptorstamceller blev injiceret i det subretinale rum hos rd10-mus ved P20, hvor fotoceptordysfunktion og degeneration er i gang36. Her beskriver vi en detaljeret protokol til fremstilling af de postkryopræserverede hESC-afledte fotoreceptorforfædre og levering til det sub-retinale rum hos rd10-mus . Denne metode kan også bruges til at administrere AAV’er, cellesuspensioner, peptider eller kemikalier i det subretinale rum hos mus.
Subretinal injektion er blevet anvendt til cellesuspensionstransplantation til behandling af RPE og retinale sygdomme 23,25,26,27,28,31,40. Denne tilgang er yderst vigtig i gnaverundersøgelser, ikke kun for celletransplantation og genterapimetoder, men også for at evaluere nye terapeutiske…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee og Yingying Chung for at yde teknisk assistance til forberedelsen af dag 32 hESC-afledte fotoreceptorforfædre efter kryopræservering. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC / OFYIRG / 0042 / 2017) og National Research Foundation 24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) til HGT.
0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |