Описан подробный протокол подготовки посткриоконсервированных клеток-предшественников фоторецепторов hESC и субретинальной доставки этих клеток у мышей rd10 .
Регенерация фоторецепторных клеток с помощью плюрипотентных стволовых клеток человека является перспективной терапией для лечения как наследственных, так и возрастных заболеваний сетчатки на поздних стадиях. Мы показали, что человеческий рекомбинантный матрица изоформы ламинина, специфичная для сетчатки, способна поддерживать дифференцировку эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) в прогениторы фоторецепторов. Кроме того, субретинальная инъекция этих клеток также показала частичное восстановление на моделях грызунов и кроликов rd10 . Субретинальная инъекция, как известно, является признанным методом, который используется для доставки фармацевтических соединений в фоторецепторные клетки и слой пигментного эпителия сетчатки (RPE) глаза из-за его близости к целевому пространству. Он также используется для доставки аденоассоциированных вирусных векторов в субретинальное пространство для лечения заболеваний сетчатки. Субретинальная доставка фармацевтических соединений и клеток в мышиной модели затруднена из-за ограничений в размере мышиного глазного яблока. В этом протоколе подробно описана процедура подготовки клеток-предшественников фоторецепторов, полученных из hESC, для инъекции и методика субретинальной доставки этих клеток у мышей с мутацией генетического пигментного ретинита, rd10 . Такой подход позволяет проводить клеточную терапию в целевой области, в частности во внешнем ядерном слое сетчатки, где происходят заболевания, приводящие к дегенерации фоторецепторов.
Наследственные заболевания сетчатки и возрастная макулярная дегенерация приводят к потере фоторецепторных клеток и, в конечном итоге, к слепоте. Фоторецептор сетчатки представляет собой наружный сегментный слой сетчатки, состоящий из специализированных клеток, ответственных за фототрансдукцию (т.е. преобразование света в нейронные сигналы). Палочковидные и колбочковые фоторецепторные клетки примыкают к пигментному слою сетчатки (РПЭ)1. Заместительная терапия фоторецепторными клетками для компенсации потери клеток является новым и развивающимся терапевтическим подходом. Для восстановления поврежденных фоторецепторных клеток использовали эмбриональные стволовые клетки (ЭСК)2,3,4, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), полученные из РПЭ, и клетки-предшественники сетчатки (РПК)4,5,6,7,8. Субретинальное пространство, ограниченное пространство между сетчаткой и РПЭ, является привлекательным местом для депонирования этих клеток для замены поврежденных фоторецепторных клеток, РПЭ и клеток Мюллера из-за его близости 9,10,11.
Генная и клеточная терапия использует субретинальное пространство для регенеративной медицины при различных заболеваниях сетчатки в доклинических исследованиях. Это включает в себя доставку функциональных копий гена или инструментов редактирования генов в форме антисмысловой олигонуклеотидной терапии12,13 или CRISPR/Cas9 или редактирования оснований с помощью стратегии 14,15,16, основанной на аденоассоциированном вирусе (AAV), имплантацию материалов (например, листа RPE, протезирования сетчатки 17,18,19) и дифференцированных органоидов сетчатки, полученных из стволовых клеток 20,21,22 для лечения заболеваний сетчатки и РПЭ. Клинические исследования с использованием hESC-RPE31 в субретинальном пространстве для лечения врожденного амавроза Лебера, ассоциированного с RPE65 (LCA)23,24, CNGA3-ассоциированной ахроматопсии25, MERTK-ассоциированного пигментного ретинита26, хороидеремии 27,28,29,30 доказали свою эффективность. Прямое введение клеток в окрестности поврежденного участка значительно повышает вероятность заселения клеток в соответствующей области, синаптической интеграции и, в конечном итоге, улучшения зрения.
Несмотря на то, что субретинальная инъекция в моделях человека и большеглазых животных (т.е. свиньи 32,33,34,35, кролика 36,37,38,39,40 и нечеловекообразного примата 41,42,43) была установлена, такая инъекция в мышиной модели все еще является сложной задачей из-за ограниченного размера глазного яблока и огромных размеров линза, занимающая глаз мыши 44,45,46. Тем не менее, генетически модифицированные модели легко доступны только для мелких животных, а не для крупных животных (т.е. кроликов и нечеловекообразных приматов), поэтому субретинальная инъекция мышам привлекает внимание к исследованию новых терапевтических подходов к генетическим заболеваниям сетчатки. Для доставки клеток или AAV в субретинальное пространство используются три основных подхода, а именно трансроговичный путь, транссклеральный путь и pars plana (см. рис. 2). Трансроговичный и транссклеральный пути связаны с образованием катаракты, синехий, хориоидейальных кровотечений и рефлюкса из места инъекции 11,44,45,47,48,49. Мы приняли подход pars plana в качестве прямой визуализации процесса инъекции, и место инъекции может быть достигнуто в режиме реального времени под микроскопом.
Недавно мы описали метод, который может дифференцировать человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭСК) в фоторецепторы-предшественники в ксеносвободных, химически определенных условиях с использованием рекомбинантной изоформы ламинина LN523, специфичной для сетчатки человека. Поскольку было обнаружено, что LN523 присутствует в сетчатке, мы предположили, что ниша внеклеточного матрикса сетчатки человека может быть рекапитулирована in vitro и тем самым поддерживать дифференцировку фоторецепторов от чЭСК36. Одноклеточный транскриптомный анализ показал, что предшественники фоторецепторов, совместно экспрессирующие конусно-палочковый гомеобокс и рекремен, генерировались через 32 дня. Модель мутантной мыши с дегенерацией сетчатки 10 (rd10), которая имитирует пигментный аутосомный ретинит человека, была использована для оценки эффективности фоторецепторов-предшественников in vivo на 32-й день hESC. Клетки-предшественники фоторецепторов, полученные из hESC, были введены в субретинальное пространство мышей rd10 на P20, где продолжается дисфункция и дегенерация фоторецептора36. В данной статье мы опишем подробный протокол подготовки посткриоконсервированных фоторецепторов-предшественников hESC и их доставки в субретинальное пространство мышей rd10 . Этот метод также может быть использован для введения AAV, клеточных суспензий, пептидов или химических веществ в субретинальное пространство у мышей.
Субретинальная инъекция была использована для трансплантации клеточной суспензии для лечения РПЭ и заболеваний сетчатки 23,25,26,27,28,31,40. Этот подход очень важен …
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Вэй Шэн Тана, Луанн Чан, Сюэ Йена, Синьи Ли и Инин Чунг за оказанную техническую помощь в подготовке фоторецепторов-предшественников на 32-й день после криоконсервации. Эта работа была частично поддержана грантами Национального совета по медицинским исследованиям (NMRC/OFYIRG/0042/2017) и грантом24-й конкурсной исследовательской программы Национального исследовательского фонда (CRP24-2020-0083) для H.G.T.
0.3% Tobramycin | Novartis | NDC 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
0.5% Proparacaine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0016-15 | 0.5% Alcaine (15 mL) |
1 mL Tuberculin syringe | Turemo | SS01T2713 | |
1% Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | 1% Mydriacyl (15 mL) |
2.5% Phenylephrine hydrochloride | Alcon | NDC 0998-0342-05 | 2.5% Mydfrin (5 mL) |
24-well tissue culture plate | Costar | 3526 | |
30 G Disposable needle | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
33 G, 20 mm length blunt needles | Hamilton | 7803-05 | |
Automated Cell Counter | NanoEnTek | Model: Eve | |
B27 without Vitamin A | Life Technologies | 12587001 | 2%36 |
Buprenorphine | Ceva | Vetergesic vet (0.3 mg/mL) | |
CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 µM36 |
Cyclosporine | Novartis | 260 g/L in drinking water | |
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells | DUKE-NUS Medical School | Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36. | |
Gauze | Winner Industries Co. Ltd. | 1SNW475-4 | |
Glasgow Minimum Essential Medium | Gibco | 11710–035 | |
hESC cell line H1 | WiCell Research Institute | WA01 | |
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 µg36 |
mFreSR | STEMCELL Technologies | 5854 | |
Microlitre glass syringe (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 µM36 |
N-2 supplement | Life Technologies | A13707-01 | 1%36 |
Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140–050 | 1x36 |
NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
Operating microscope | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | With Built-in iOCT function |
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml) | DUKE-NUS Medical School | See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA). | |
Pyruvate | Gibco | 11360–070 | 1 mM36 |
Rd10 mice | Jackson Laboratory | B6.CXB1-Pde6brd10/J mice | Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g |
Retinoic acid | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 µM36 |
Round Cover Slip (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 µM36 |
Vidisic Gel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985–023 | 0.1 mM36 |