Här presenterar vi ett optimerat protokoll för cytokinesblockering av mikrokärnor på kryokonserverade helblodsprover. Denna optimerade metod för kryokonservering av helblod för analys av mikrokärnor är en tillförlitlig teknik för storskalig provtagning och multicenterstudier och kan även användas för andra blodrelaterade analyser.
In vitro cytokinesis-block micronucleus (CBMN) -analysen är en allmänt använd teknik inom radiobiologisk forskning, biologisk dosimetri, genotoxicitetsstudier och in vitro strålningskänslighetstestning. Denna cytogenetiska metod bygger på detektion av mikrokärnor i binukleära celler som härrör från kromosomfragment som släpar efter under celldelningen. Färska helblodsprover är den mest föredragna provtypen för CBMN-analysen. Nackdelarna med att arbeta med färska blodprover är dock omedelbar bearbetning efter blodprovstagning och det begränsade antalet upprepade analyser som kan utföras utan extra blodprovstagning.
Eftersom behovet av färska blodprover kan vara logistiskt utmanande, skulle CBMN-analys på kryokonserverade helblodsprover vara till stor fördel, särskilt i storskaliga patientstudier. Denna artikel beskriver ett protokoll för att frysa helblodsprover och för att utföra CBMN-analysen på dessa frysta blodprover. Blodprover från friska frivilliga har frysts och tinats vid olika tidpunkter och sedan utsatts för ett modifierat analysprotokoll för mikrokärnor. Resultaten visar att denna optimerade procedur gör det möjligt att utföra CBMN-analysen på frysta blodprover. Det beskrivna kryokonserveringsprotokollet kan också vara mycket användbart för andra cytogenetiska analyser och en mängd olika funktionella analyser som kräver prolifererande lymfocyter.
Ända sedan upptäckten har användningen av joniserande strålning (IR) varit föremål för debatt bland forskare på grund av dess negativa effekter på levande varelser. Den skadliga effekten manifesteras vanligtvis av DNA-skador som dubbelsträngade brott (DSB), och misslyckandet med att reparera dessa DSB leder till kromosomavvikelser och mutationer, vilket är viktiga kännetecken för cancer 1,2. Sådana kromosomavvikelser kan undersökas med cytogena analyser, t.ex. CBMN-testet (cytokinesis-block micronucleus). Mikrokärnor är eftersläpande kromosomfragment som inte kan inkorporeras i dotterkärnor och därför lämnas kvar under mitosen.
CBMN är en vanlig, tillförlitlig cytogenetisk teknik för att bedöma kromosomskador hos individer som exponerats för joniserande strålning in vivo eller in vitro. Antingen färskt helblod eller isolerade mononukleära celler (PBMC) i perifert blod kan användas i CBMN-analysen. Färskt helblod är mestadels det biologiska materialet eftersom isolering och bearbetning av PBMC kan vara tidskrävande och åtföljs av en förlust av serumplasma som fungerar som det stödjande mediet för cellöverlevnad och tillväxt. För att uppnå ett bra utbyte av binukleära celler bör färskt helblod bearbetas omedelbart efter insamlingen. Behovet av omedelbar bearbetning kan dock vara logistiskt utmanande under tidspress. Dessutom, när många prover är tänkta att tas under en längre period eller samlas in på platser utanför bearbetningscentren, kan lagring av färska blodprover vara en begränsande faktor 3,4.
Vidare, för att möjliggöra upprepad MN-analys hos samma individ/patient, skulle frysning av blodprover vara fördelaktigt. Ett sätt att lagra lymfocyter för senare applicering av CBMN-analysen är genom att frysa isolerade PBMC 5,6. Denna teknik kräver dock flera bearbetningssteg innan PBMC:erna kan frysas. Därför skulle kryokonservering av helblod utgöra ett enkelt och tidseffektivt alternativ till kryokonservering av isolerade PBMC. Det finns inte mycket information om användningen av fryst helblod för cytogenetiska analyser eller analyser som kräver proliferation av lymfocyter. Endast en artikel rapporterar användningen av kryokonserverat helblod för metafasanalys7.
Eftersom kryokonservering av helblod skulle erbjuda många fördelar inom området biomonitorering, biodosimetri och bedömning av strålkänslighet, optimerade vår grupp ett kryokonserveringsprotokoll för helblod som möjliggör tillämpning av CBMN-analysen8. Vi visade att lymfocyter som finns i kryokonserverade helblodskulturer behåller sin genomiska integritet och proliferationskapacitet i minst 1 år. I denna metodartikel beskriver vi i detalj kryokonserveringsproceduren och CBMN-analysprotokollet, som optimerades av Beyls et al.8, och rapporterar resultat som erhållits för frysta blodprover från 30 friska individer. För CBMN-analysen bestrålades blodkulturerna in vitro med doser på 0,5, 1 och 2 Gy för att bedöma MN-svaret i lymfocyter från kryokonserverade helblodsprover.
Det modifierade protokollet för applicering av CBMN-analysen är ett relativt enkelt och bekvämt sätt att lagra blodprover i bulk. Proceduren beskriver alla små men viktiga detaljer som måste tas om hand under kryokonservering och CBMN-analysen. Andra labbprotokoll använder normalt 10 % DMSO i frysblandningen, medan vår frysblandning innehåller 20 % DMSO tillsammans med 80 % FCS7. Eftersom denna frysblandning tillsätts i lika stora volymer till helblodsprovet är den slutliga koncentrationen också 10 % DMSO. För att förbättra cellöverlevnaden och stimulera celldelningen tillsätter vi 1 % natriumpyruvat och 0,1 % beta-merkaptoetanol till det kompletta odlingsmediet (cRPMI). Detta är i enlighet med det cellodlingsprotokoll som fastställts av vår forskargrupp 6,8.
Även om problemet med cellklumpar under upptining inte kunde lösas helt i detta protokoll, var cellsegregeringen bättre än de andra konventionella protokollen. Istället för konsekvent, abrupt tillsats av odlingsmedia för att återvinna celler efter upptining, fick vi bättre resultat när förvärmd PBS (37 °C) tillsattes droppvis under tvättstegen. Denna förbättring hjälper till att minska cellulär stress och minimerar klumpar med en bevisad hög återhämtning av celler. Dessutom kunde ingen tydlig skillnad i cellviabilitet observeras när PBS användes över RPMI. Det har validerats av gruppen att längden på kryokonserveringsperioden (upp till 1 år) inte kommer att påverka MN-avkastningen, både i bestrålade och icke-bestrålade prover 6,8. Studier tyder på att god cellviabilitet och proliferation av PBMC kan uppnås med gradvis frysning vid låga temperaturer (flytande kväve), följt av gradvis tillsats av förvärmt medium under upptining 10,11. Forskare har visat att subpopulationerna av T-lymfocyter i tinat helblod är jämförbara med de som observerats i tinat PBMC12. Vidare är det bevisat att cellsubtyper som återvunnits från kryokonserverade helblodsprover liknar de som observerats i färska helblodsprover13,14.
Om vi undersöker de indikativa resultaten som erhållits i rapporten ser vi att den linjära kvadratiska ökningen med dos (Figur 3) överensstämmer med andra litteraturrapporter om linjär energiöverföring (LET)-inducerade mikrokärnor15,16. Variationen i MN-avkastning som observerats i de kryokonserverade helblodsproverna (tabell 1) ligger inom intervallet med den som rapporterats för färska helblodsodlingar 8,17,18. Protokollet som beskrivs i detalj här validerades på färskt och kryokonserverat helblod från 20 friska frivilliga8. Det nukleära delningsindexet (NDI), som är en viktig parameter för cellproliferation som observerades i den rapporten8, överensstämde med det som föreslogs för färskt helblod19,20. Sammantaget ger detta optimerade protokoll för kryokonservering av helblod och modifierad mikrokärnanalys ett bättre cellutbyte och därför rekommenderas anpassning av detta protokoll för strålkänslighetsbedömningar. Eftersom protokollets reproducerbarhet redan har validerats8, föreslås det att det kan tillämpas i storskaliga studier och multicenterstudier.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka L. Pieters, T. Thiron och G. De Smet för deras tekniska stöd. Vi är tacksamma för alla frivilliga som donerade blod till studien. Arbetet stöddes ekonomiskt av Stiftelsen för forskning i Flandern (FWO) inom ramen för anslag (T000118N).
15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188271 | |
24-well cell suspension plate | VWR | 734-2779 | |
96% alcohol | ChemLab | CL00.1807.2500 | |
Acetic acid | Merck life science | 8,18,75,52,500 | |
Acridine orange | Merck life science | 235474-5g | |
CaCl2 | Merck life science | C5670-100g | |
cover slips | VWR | 631-1365 | 22 x 50 |
Cryobox (Mr.Frosty) | Nalgene, Sigma Aldrich | ||
Cryovials 2ml | Novolab | A04573 | |
Cytochalsin B | Merck life science | C6762-10 | 10 mg |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Merck life science | D4540-500ml | |
Fetal calf serum (FCS) | Thermo Fischer scientific | 10270-106 | |
Fixative 1 | Methanol/acetic acid/ringer in a ratio of 4:1:5 | ||
Fixative 2 | Methanol/acetic acid in a ratio of 4:1 | ||
GURR buffer | Thermo Fischer scientific | 10582013 | phosphate buffer (pH 6.8) |
KCl | Merck life science | 1,04,93,60,250 | 75 mM |
KH2PO4 | Merck life science | 1,04,87,30,250 | |
Li-heparin tubes | BD Life sciences | 367526-LH170 I.U. | BD Vacutainer |
Methanol | fisher scinetific | M/4000/17 | |
Na2HPO2 | Merck life science | 10,65,80,500 | |
NaCl | Merck life science | S7653-1kg | |
Object slides | VWR | MENZAA00000112E04 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer scientific | 15140-122 | 10,000 U/mL + 10,000 µg/mL |
Phytohemagglutinin (PHA-M) | Thermo Fischer scientific | 10576-015 | |
Ringer solution | contains NaCl, KCl, CaCl2 dissolved in distilled water | ||
RPMI-1640 | Thermo Fischer scientific | 52400041 | |
Silicon rubber adhesive sealent | collall | CF-100 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fischer scientific | 11360039 | |
Sterile warm PBS (37 °C) | contains NaCl, Na2HPO2, KH2PO4 dissolved in distilled water | ||
β-mercaptoethanol | Thermo Fischer scientific | 31350-010 |