Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing
Summary
여기서는 마우스 경동맥의 단세포 현탁액을 준비하기 위한 2단계 세포 분해 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
경동맥은 뇌에 혈액과 산소를 공급하는 목의 주요 혈관이지만, 경동맥 협착증은 플라크로 경동맥이 막힐 때 발생합니다. 단세포 수준에서 경동맥의 세포 구성을 밝히는 것은 경동맥 죽상동맥경화증 치료에 필수적입니다. 그러나 경동맥에서 단세포 현탁액을 제조하기 위해 즉시 사용할 수 있는 프로토콜은 없습니다. 세포 손상을 줄이면서 단세포 수준에서 정상 경동맥을 해리하는 데 적합한 프로토콜을 얻기 위해 콜라겐분해효소/DNase와 트립신의 분해 과정을 통합하여 2단계 소화 방법을 설계했습니다. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) 이중 형광 계수를 사용하여 세포 생존율과 농도를 검출했으며, 단일 세포 현탁액이 85% 이상의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 염기서열 분석 요구 사항을 충족하는 것으로 나타났습니다. 단일 세포 데이터 처리 후 각 경동맥 세포에서 세포당 ~2500개의 전사체 중앙값이 검출되었습니다. 특히, 혈관 평활근 세포(VSMC), 섬유아세포, 내피세포(EC), 대식세포 및 수지상세포(Mφ/DC)를 포함한 정상 경동맥의 다양한 세포 유형이 동시에 검출되었습니다. 이 프로토콜은 적절한 변형을 갖는 다른 조직으로부터의 혈관의 단세포 현탁액을 제조하기 위해 적용될 수 있다.
Introduction
죽상동맥경화증은 고혈압, 고지혈증, 혈류역학 등의 위험인자와 관련된 만성 염증성 질환이다1. 경동맥 분기는 혈역학적 변화가 일어나기 쉬우며 경동맥 플라크 형성을 유발합니다. 경동맥 죽상동맥경화증의 임상적 양상은 뇌졸중, 일과성 뇌허혈과 같은 급성일 수도 있고, 재발성 일과성 뇌허혈, 혈관성 치매와 같은 만성일 수도 있다2. 기계적으로 경동맥 플라크는 병리학적 조건에서 서로 다른 혈관 벽 세포와 다양한 혈액 세포 간의 상호 작용의 결과입니다. 따라서 생리학적 및 병리학적 조건에서 경동맥의 단세포 아틀라스를 밝히는 것은 경동맥 플라크 발생을 예방하고 치료하는 데 특히 중요합니다.
단일 세포 RNA 염기서열 분석은 초고분해능과 동일한 세포 유형의 유기체에서 세포 이질성을 검출하기 때문에 생물학 연구의 가장 강력한 기술중 하나입니다 3,4. 연구자들은 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 사용하여 심혈관 질환5 및 암6과 같은 많은 분야에서 연구를 수행했습니다. 그러나 조직을 단일 세포로 빠르고 정확하게 분리하는 것은 여전히 주요 과제 중 하나입니다. 효소 해리는 콜라겐분해효소, 파파인, 트립신, DNase 및 히알루로니다아제를 주로 포함하는 일반적으로 사용되는 방법입니다. 특히, 콜라겐분해효소는 단세포 소화를 위한 주요 효소 종으로, 주로 결합 조직의 콜라겐 성분을 가수분해합니다. 다양한 콜라겐분해효소 유형은 유선7, 사구체8, 홍채각9, 무릎관절10, 대동맥11, 폐12와 같은 다양한 조직의 해리에 적용할 수 있다. 서로 다른 조직의 고유한 생리학적 특성으로 인해 동일한 방법을 사용한 해리는 낮은 세포 생존율, 낮은 세포 수 및 큰 세포 파편과 같은 단일 세포를 획득하는 데 많은 문제를 일으킬 수 있습니다. 그러므로, 상이한 조직에 대한 분해 방법의 발명은 고품질 단세포 현탁액을 제조하는 데 필수적이다.
이 프로토콜은 야생형 마우스의 경동맥의 단세포 현탁액을 제조하기 위한 2단계 세포 분해 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다. 경동맥의 특성에 따라 콜라겐분해효소/DNase와 트립신을 결합하여 생쥐 경동맥의 고품질 단세포 현탁액을 얻었는데, 이는 콜라겐분해효소가 경동맥 조직의 콜라겐을 가수분해할 수 있기 때문이며, 이는 트립신에 의해 단세포 현탁액으로 더 소화되었습니다. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) 이중 형광 계수를 사용하여 세포 생존율과 농도를 검출했으며, 단일 세포 현탁액이 85% 이상의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 염기서열 분석 요구 사항을 충족하는 것으로 나타났습니다. 단일 세포 데이터 처리 후 소화 후 정상 마우스 경동맥에서 혈관 평활근 세포(VSMC), 섬유아세포, 내피 세포(EC), 대식세포 및 수지상 세포(Mφ/DC)를 포함한 4가지 세포 유형이 확인되었습니다. 이 프로토콜의 장점은 1) 경동맥의 여러 세포 유형을 식별할 수 있고, 2) 세포 생존율이 잘 보존되며, 3) 특별한 장비 없이 쉽게 반복할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 마우스 경동맥의 단세포 다중체학 연구에 관심이 있는 연구자에게 적합합니다. 이 프로토콜은 적절한 변형을 통해 다른 혈관을 해리하는 데에도 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 야생형 마우스의 경동맥에서 콜라겐분해효소/DNase 및 트립신의 소화 과정을 통합하는 2단계 소화 방법을 구축한 고품질 단세포 현탁액을 제조하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 단일 세포 현탁액의 품질 검사 후, 우리는 그것이 85% 이상의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 시퀀싱에 대한 요구 사항을 충족한다는 것을 발견했습니다. 또한 VSMC, 섬유아세포, EC 및 Mφ/DC를 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 자연과학재단(82070450 to C.T.and 82170466 to L.Z.)과 중국 박사후 과학 재단(China Postdoctoral Science Foundation)의 펠로우십(7121102223 to F.L.)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 0.25% EDTA-free trypsin | Beyotime | C0205 | Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS. |
| 0.9% NaCl saline solution | Beyotime | ST341 | Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL |
| 1 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r009 | To perform cardiac perfusion |
| 1.5 mL centrifuge tubes | KIRGEN | KG2211W | To centrifuge the tissue piece and cell suspension |
| 20 mL syringes | SKJYLEAN | sk-r013 | To perform cardiac perfusion |
| 40 µm cell strainer | JETBIOFIL | css010040 | To filter undigested tissue fragments |
| AO/PI kit | Hengrui Biological | RE010212 | To identify whether the cell is alive or dead |
| Automated cell counter | Countstar | Mira FL | To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells |
| Cell Ranger software | 10× Genomics | 3.0.2 | To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis |
| Chromium Single Cell 3'Reagent Kits v3 | 10× Genomics | 1000075 | To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL |
| Deoxyribonuclease I | Worthington | LS002140 | Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30088.03 | Termination of the digestion reaction |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14175095 | Store at the room temperture |
| Heparin sodium salt | Solarbio Life Science | H8060 | Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | Applied for spining down the tissues and cell pellets |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | Sequencer |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio Life Science | P1000 | Used for cardiac perfusion and resuspension of cells |
| Seurat package- R | Satija Lab | 3.1.2 | To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data |
| Six-well cell culture plates | NEST | 703002 | Place the vascular tissue |
| Water bath | Jinghong | DK-S22 | Keep the digestion temperature at 37 °C |
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