إنشاء نموذج فسيولوجي للأورام الدقيقة الوعائية البشرية لأبحاث السرطان
Summary
يقدم هذا البروتوكول نموذجا ذا صلة من الناحية الفسيولوجية للورم على الرقاقة لإجراء أبحاث السرطان البشري الأساسية والتحويلية عالية الإنتاجية ، وتطوير فحص الأدوية ، ونمذجة الأمراض ، ومناهج الطب الشخصي مع وصف لإجراءات التحميل والصيانة والتقييم.
Abstract
لا يزال الافتقار إلى نماذج السرطان التي تم التحقق من صحتها والتي تلخص البيئة المكروية للورم للسرطانات الصلبة في المختبر يمثل عنق زجاجة كبير لأبحاث السرطان قبل السريرية والتطوير العلاجي. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بتطوير الورم المجهري الوعائي (VMT) ، أو رقاقة الورم ، وهو نظام فسيولوجي دقيق يقوم بشكل واقعي بنمذجة البيئة المكروية المعقدة للورم البشري. يتشكل VMT من جديد داخل منصة الموائع الدقيقة من خلال الزراعة المشتركة لأنواع متعددة من الخلايا البشرية في ظل ظروف التدفق الفسيولوجي الديناميكي. يشتمل هذا البناء الهندسي للورم الدقيق المصمم على الأنسجة على شبكة أوعية دموية حية تدعم كتلة الورم المتنامية تماما كما تفعل الأوعية المشكلة حديثا في الجسم الحي. الأهم من ذلك ، يجب أن تعبر الأدوية والخلايا المناعية الطبقة البطانية للوصول إلى الورم ، ونمذجة الحواجز الفسيولوجية في الجسم الحي أمام التسليم العلاجي والفعالية. نظرا لأن منصة VMT شفافة بصريا ، يمكن تحقيق تصوير عالي الدقة للعمليات الديناميكية مثل تسرب الخلايا المناعية وورم خبيث من خلال التصور المباشر للخلايا ذات العلامات الفلورية داخل الأنسجة. علاوة على ذلك ، يحتفظ VMT بعدم تجانس الورم في الجسم الحي ، وتوقيعات التعبير الجيني ، والاستجابات الدوائية. يمكن تكييف أي نوع من الأورام تقريبا مع المنصة ، وتنمو الخلايا الأولية من الأنسجة الجراحية الطازجة وتستجيب للعلاج الدوائي في VMT ، مما يمهد الطريق نحو الطب الشخصي حقا. هنا ، يتم تحديد طرق إنشاء VMT واستخدامه لأبحاث الأورام. يفتح هذا النهج المبتكر إمكانيات جديدة لدراسة الأورام والاستجابات الدوائية ، مما يوفر للباحثين أداة قوية لتطوير أبحاث السرطان.
Introduction
لا يزال السرطان مصدر قلق صحي كبير في جميع أنحاء العالم وهو السبب الرئيسي الثاني للوفاة في الولايات المتحدة. بالنسبة لعام 2023 وحده ، يتوقع المركز الوطني للإحصاءات الصحية حدوث أكثر من 1.9 مليون حالة سرطان جديدة وأكثر من 600000 حالة وفاة بالسرطان في الولايات المتحدة1 ، مما يسلط الضوء على الحاجة الملحة لنهج علاجية فعالة. ومع ذلك ، في الوقت الحالي ، فإن 5.1٪ فقط من العلاجات المضادة للسرطان التي تدخل التجارب السريرية تحصل في النهاية على موافقة إدارة الغذاء والدواء. يمكن أن يعزى فشل المرشحين الواعدين في التقدم بنجاح من خلال التجارب السريرية جزئيا إلى استخدام أنظمة النماذج غير الفسيولوجية ، مثل 2D والثقافات الكروية ، أثناء تطوير الأدوية قبل السريرية2. تفتقر نماذج السرطان الكلاسيكية هذه إلى المكونات الأساسية للبيئة المكروية للورم ، مثل مكانة اللحمة ، والخلايا المناعية المرتبطة بها ، والأوعية الدموية المثقوبة ، والتي تعد محددات رئيسية للمقاومة العلاجية وتطور المرض. وبالتالي ، فإن نظاما نموذجيا جديدا يحاكي بشكل أفضل البيئة المكروية للورم البشري في الجسم الحي ضروري لتحسين الترجمة السريرية للنتائج قبل السريرية.
يتقدم مجال هندسة الأنسجة بسرعة ، مما يوفر طرقا محسنة لدراسة الأمراض البشرية في البيئات المختبرية. أحد التطورات المهمة هو ظهور الأنظمة الفسيولوجية الدقيقة (MPS) ، والمعروفة أيضا باسم رقائق الأعضاء أو رقائق الأنسجة ، وهي أعضاء بشرية وظيفية مصغرة قادرة على تكرار الحالات الصحية أو المريضة3،4،5. في هذا السياق ، تم تطوير رقائق الورم ، وهي نماذج أورام بشرية ثلاثية الأبعاد تعتمد على الموائع الدقيقة في المختبر ، لأبحاث الأورام2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12،13. تتضمن هذه النماذج المتقدمة إشارات كيميائية حيوية وفيزيائية حيوية داخل بيئة دقيقة ديناميكية للورم ، مما يمكن الباحثين من دراسة سلوك الورم والاستجابات للعلاجات في سياق أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية. ومع ذلك ، على الرغم من هذه التطورات ، نجحت مجموعات قليلة في دمج الأوعية الدموية الحية والوظيفية ، لا سيما تلك التي تتبع الأنماط الذاتية استجابة للتدفق الفسيولوجي3،4،5،6. يعد تضمين شبكة الأوعية الدموية الوظيفية أمرا بالغ الأهمية لأنه يسمح بنمذجة الحواجز المادية التي تؤثر على توصيل الدواء أو الخلايا ، وتوجيه الخلايا إلى بيئات دقيقة متميزة ، والهجرة عبر البطانية للورم والخلايا اللحمية والخلايا المناعية. من خلال تضمين هذه الميزة ، يمكن لشريحة الورم أن تمثل بشكل أفضل التعقيدات التي لوحظت في البيئة المكروية للورم في الجسم الحي .
لتلبية هذه الحاجة غير الملباة ، قمنا بتطوير منصة جديدة لفحص الأدوية تمكن شبكات الأوعية الدقيقة من التشكل داخل جهاز الموائع الدقيقة8،9،10،11،12،13،14،15،16. يمكن تكييف منصة رقاقة الأعضاء الأساسية هذه ، والتي يطلق عليها اسم العضو الدقيق الوعائي (VMO) ، مع أي نظام عضوي تقريبا لتكرار فسيولوجيا الأنسجة الأصلية لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية وتطبيقات الطب الشخصي. يتم إنشاء VMOs عن طريق الزراعة المشتركة للخلايا البطانية المشتقة من الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية (ECFC-EC) ، HUVEC أو iPSC-EC (المشار إليها فيما يلي باسم EC) ، والخلايا اللحمية المتعددة في الغرفة ، بما في ذلك الخلايا الليفية الرئوية البشرية الطبيعية (NHLF) ، التي تعيد تشكيل المصفوفة ، والخلايا المحيطة التي تلف الأوعية وتستقرها. يمكن أيضا إنشاء VMO كنظام نموذجي للسرطان عن طريق زراعة الخلايا السرطانية مع السدى المرتبط بها لإنشاء ورم دقيق وعائي (VMT) 8،9،10،11،12،13 ، أو نموذج رقاقة الورم. من خلال الثقافة المشتركة لأنواع متعددة من الخلايا في بيئة تدفق ديناميكية ، تتشكل شبكات الأوعية الدموية الدقيقة المثقوبة من جديد في غرف الأنسجة بالجهاز ، حيث يتم تنظيم تكوين الأوعية الدموية عن كثب من خلال معدلات التدفق الخلالي14,15. يتم دفع الوسط عبر قنوات الموائع الدقيقة للجهاز بواسطة رأس ضغط هيدروستاتيكي يزود الخلايا المحيطة بغرفة الأنسجة بالمغذيات حصريا من خلال الأوعية الدقيقة ، مع معامل نفاذية يبلغ 1.2 × 10-7 سم / ثانية ، على غرار ما يظهر للشعيرات الدموية في الجسم الحي8.
يمثل دمج الأوعية الدقيقة ذاتية التنظيم في نموذج VMT إنجازا كبيرا لأنه: 1) يحاكي بنية ووظيفة كتل الورم الوعائية في الجسم الحي. 2) يمكن نمذجة الخطوات الرئيسية للورم الخبيث ، بما في ذلك تفاعلات الخلايا البطانية والورم ؛ 3) يضع حواجز انتقائية من الناحية الفسيولوجية لتوصيل المغذيات والأدوية ، وتحسين الفحص الصيدلاني ؛ و 4) يسمح بالتقييم المباشر للأدوية ذات القدرات المضادة لتولد الأوعية ومكافحة النقيلي. من خلال تكرار التسليم في الجسم الحي للمغذيات والأدوية والخلايا المناعية في بيئة دقيقة 3D معقدة ، فإن منصة VMO / VMT هي نموذج ذي صلة من الناحية الفسيولوجية يمكن استخدامه لإجراء فحص الأدوية ودراسة السرطان أو الأوعية الدموية أو البيولوجيا الخاصة بالأعضاء. الأهم من ذلك ، أن VMT يدعم نمو أنواع مختلفة من الأورام ، بما في ذلك سرطان القولون ، وسرطان الجلد ، وسرطان الثدي ، والورم الأرومي الدبقي ، وسرطان الرئة ، وسرطان البريتوني ، وسرطان المبيض ، وسرطان البنكرياس8،9،10،11،12،13. بالإضافة إلى كونها منخفضة التكلفة ، وسهلة التأسيس ، ومصفوفة للتجارب عالية الإنتاجية ، فإن منصة الموائع الدقيقة متوافقة بصريا تماما لتحليل الصور في الوقت الفعلي للتفاعلات بين الورم وانسجة والاستجابة للمنبهات أو العلاجات. يتم تمييز كل نوع من الخلايا في النظام بعلامة فلورسنت مختلفة للسماح بالتصور المباشر وتتبع سلوك الخلية طوال التجربة بأكملها ، مما يخلق نافذة على البيئة المكروية الديناميكية للورم. لقد أظهرنا سابقا أن VMT أكثر دقة في نمو الورم الحي ، والهندسة المعمارية ، وعدم التجانس ، وتوقيعات التعبير الجيني ، واستجابات الأدوية من طرائق الثقافة القياسية10. الأهم من ذلك ، أن VMT يدعم نمو ودراسة الخلايا المشتقة من المريض ، بما في ذلك الخلايا السرطانية ، والتي تقدم نماذج أفضل لأمراض الأورام الأم من الثقافات الكروية القياسية وتزيد من تقدم جهود الطب الشخصي11. توضح هذه المخطوطة طرق إنشاء VMT ، وتعرض فائدتها في دراسة السرطانات البشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتلقى كل نسيج في الجسم تقريبا العناصر الغذائية والأكسجين من خلال الأوعية الدموية ، مما يجعله مكونا حاسما لنمذجة المرض الواقعية وفحص الأدوية في المختبر. علاوة على ذلك ، يتم تعريف العديد من الأورام الخبيثة وحالات المرض من خلال خلل وظيفي في بطانة الأوعية الدموية وفرط النفاذية…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر الدكتور كريستوفر هيوز على مساهمتهم القيمة في الإجراءات الموصوفة ، وكذلك المتعاونين معنا في مختبر الدكتور أبراهام لي لمساعدتهم في تصميم المنصة وتصنيعها. تم دعم هذا العمل من خلال المنح التالية: UG3 / UH3 TR002137 و R61 / R33 HL154307 و 1R01CA244571 و 1R01 HL149748 و U54 CA217378 (CCWH) و TL1 TR001415 و W81XWH2110393 (SJH).
Materials
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
- Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. Applications of tumor chip technology. Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).
- Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W. The vascular niche in next generation microphysiological systems. Lab Chip. 21 (17), 3615-3616 (2021).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Vascularized microfluidic organ-chips for drug screening, disease models and tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 52, 116-123 (2018).
- Shirure, V. S., Hughes, C. C. W., George, S. C. Engineering vascularized organoid-on-a-chip models. Annu Rev Biomed Eng. 23, 141-167 (2021).
- Del Piccolo, N., et al. Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis. Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798 (2021).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nat Rev Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Sci Rep. 6, 31589 (2016).
- Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
- Hachey, S. J., et al. An in vitro vascularized micro-tumor model of human colorectal cancer recapitulates in vivo responses to standard-of-care therapy. Lab Chip. 21 (7), 1333-1351 (2021).
- Hachey, S. J., et al. A Human Vascularized Micro-Tumor Model of Patient-Derived Colorectal Cancer Recapitulates Clinical Disease. Transl Res. 255, 97-108 (2023).
- Liu, Y., et al. Human in vitro vascularized micro-organ and micro-tumor models are reproducible organ-on-a-chip platforms for studies of anticancer drugs. Toxicology. 445, 152601 (2020).
- Jahid, S., et al. Structure-based Design of CDC42 Effector Interaction Inhibitors for the Treatment of Cancer. Cell Rep. 39 (4), 110760 (2022).
- Hsu, Y. H., Moya, M. L., Hughes, C. C. W., George, S. C., Lee, A. P. A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological vascularized tissue arrays. Lab Chip. 13 (15), 2990-2998 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Christopher, C. W. H., George, S. C. In vitro perfused human capillary networks. Tissue Eng – Part C: Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Wang, X., et al. An on-chip microfluidic pressure regulator that facilitates reproducible loading of cells and hydrogels into microphysiological system platforms. Lab Chip. 16 (5), 868-876 (2016).
- Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Exp Biol Med. 242 (17), 1669-1678 (2017).
- Kurokawa, Y. K., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells for three-dimensional microphysiological systems. Tissue Eng Part C: Methods. 23 (8), 474-484 (2017).
- Romero-López, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS one. 6 (11), e27385 (2011).
- Corliss, B. A., et al. REAVER: A program for improved analysis of high-resolution vascular network images. Microcirculation. 27 (5), e12618 (2020).
- Urban, G., et al. Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images. IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).
