建立用于癌症研究的生理性人血管化微肿瘤模型
Summary
该协议提出了一种生理学相关的肿瘤芯片模型，用于执行高通量基础和转化人类癌症研究，推进药物筛选、疾病建模和个性化医疗方法，并描述了加载、维持和评估程序。
Abstract
缺乏经过验证的癌症模型来概括 体外 实体癌的肿瘤微环境仍然是临床前癌症研究和治疗开发的重大瓶颈。为了克服这个问题，我们开发了血管化微肿瘤（VMT）或肿瘤芯片，这是一种微生理系统，可以真实地模拟复杂的人类肿瘤微环境。VMT通过在动态生理流动条件下共培养多种人类细胞类型，在微流控平台 内从头 形成。这种组织工程微肿瘤结构包含一个活的灌注血管网络，该网络支持不断增长的肿瘤块，就像新形成的血管 在体内一样。重要的是，药物和免疫细胞必须穿过内皮层才能到达肿瘤， 从而 模拟体内治疗递送和疗效的生理障碍。由于VMT平台是光学透明的，因此可以通过直接可视化组织内荧光标记的细胞来实现免疫细胞外渗和转移等动态过程的高分辨率成像。此外，VMT保留了 体内 肿瘤异质性、基因表达特征和药物反应。几乎任何肿瘤类型都可以适应该平台，来自新鲜手术组织的原代细胞在VMT中生长并对药物治疗做出反应，为真正的个性化医疗铺平了道路。本文概述了建立VMT并将其用于肿瘤学研究的方法。这种创新方法为研究肿瘤和药物反应开辟了新的可能性，为研究人员提供了推进癌症研究的有力工具。
Introduction
癌症仍然是全球主要的健康问题，也是美国的第二大死因。仅在 2023 年，美国国家卫生统计中心就预计美国将有超过 190 万例新发癌症病例和超过 600,000 例癌症死亡1，这凸显了对有效治疗方法的迫切需要。然而，目前，只有5.1%的进入临床试验的抗癌疗法最终获得了FDA的批准。有希望的候选药物未能成功通过临床试验可部分归因于在临床前药物开发过程中使用了非生理模型系统，例如 2D 和球状培养物 2。这些经典癌症模型缺乏肿瘤微环境的基本组成部分，例如基质生态位、相关免疫细胞和灌注脉管系统，这些都是治疗耐药性和疾病进展的关键决定因素。因此，为了改善临床前发现的临床转化，需要一种更好地模拟人类 体内 肿瘤微环境的新模型系统。
组织工程领域正在迅速发展，为在实验室环境中研究人类疾病提供了改进的方法。一个重要的发展是微生理系统（MPS）的出现，也称为器官芯片或组织芯片，它们是功能性的小型化人体器官，能够复制健康或疾病条件3,4,5。在此背景下，肿瘤芯片是基于三维微流控的体外人类肿瘤模型，已被开发用于肿瘤学研究2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 .这些先进的模型在动态肿瘤微环境中结合了生物化学和生物物理线索，使研究人员能够在更相关的生理环境中研究肿瘤行为和对治疗的反应。然而，尽管有这些进步，但很少有小组成功地整合了活的、功能性的脉管系统，特别是响应生理流动的自我模式的脉管系统3,4,5,6。功能性血管网络的加入至关重要，因为它允许对影响药物或细胞递送的物理屏障、细胞归巢到不同微环境以及肿瘤、基质和免疫细胞的跨内皮迁移进行建模。通过包含这一特征，肿瘤芯片可以更好地表示在体内肿瘤微环境中观察到的复杂性。
为了满足这一未满足的需求，我们开发了一种新型药物筛选平台，使微流控装置8,9,10,11,12,13,14,15,16形成微血管网络。这种基础器官芯片平台被称为血管化微器官 （VMO），几乎可以适应任何器官系统，以复制原始组织生理学，用于疾病建模、药物筛选和个性化医疗应用。VMO 是通过共培养内皮集落形成细胞来源的内皮细胞 （ECFC-EC）、HUVEC 或 iPSC-EC（以下简称 EC）和腔室中的多个基质细胞（包括重塑基质的正常人肺成纤维细胞 （NHLF）和包裹和稳定血管的周细胞）来建立的。VMO也可以通过将肿瘤细胞与相关基质共培养来建立为癌症模型系统，以创建血管化微肿瘤（VMT）8,9,10,11,12,13或肿瘤芯片模型。通过在动态流动环境中共培养多种细胞类型，灌注的微血管网络在装置的组织室中从头形成，其中血管生成受到间质流速的密切调节14,15。培养基由静水压力头驱动通过设备的微流体通道，静水压力头仅通过微血管为组织室的周围细胞提供营养，渗透系数为 1.2 x 10-7 cm/s，类似于体内毛细血管的可见值 8。
将自组织微血管纳入VMT模型代表了一项重大突破，因为它：1）模拟体内血管化肿瘤肿块的结构和功能;2）可以模拟转移的关键步骤，包括肿瘤-内皮细胞和基质细胞相互作用;3）建立营养和药物递送的生理选择性屏障，改善药物筛选;4）允许直接评估具有抗血管生成和抗转移能力的药物。通过在复杂的 3D 微环境中复制营养物质、药物和免疫细胞的体内递送，VMO/VMT 平台是一种生理相关模型，可用于进行药物筛选和研究癌症、血管或器官特异性生物学。重要的是，VMT 支持各种类型肿瘤的生长，包括结肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、胶质母细胞瘤、肺癌、腹膜癌、卵巢癌和胰腺癌 8,9,10,11,12,13。除了成本低、易于建立和排列用于高通量实验外，微流控平台还完全光学兼容，可用于肿瘤-基质相互作用和对刺激或治疗的反应的实时图像分析。系统中的每种细胞类型都用不同的荧光标记物标记，以便在整个实验过程中直接可视化和跟踪细胞行为，从而为动态肿瘤微环境创造一个窗口。我们之前已经表明，与标准培养模式相比，VMT 更忠实地模拟体内肿瘤生长、结构、异质性、基因表达特征和药物反应10。重要的是，VMT支持患者来源细胞（包括癌细胞）的生长和研究，与标准球状体培养物相比，它更好地模拟了母体肿瘤的病理学，并进一步推进了个性化医疗工作11。这份手稿概述了建立VMT的方法，展示了其在研究人类癌症方面的效用。
Protocol
Representative Results
Discussion
身体中几乎每个组织都通过脉管系统获得营养和氧气，使其成为现实疾病建模和 体外药物筛选的关键组成部分。此外，几种恶性肿瘤和疾病状态由血管内皮功能障碍和高通透性定义 3。值得注意的是，在癌症中，肿瘤相关的脉管系统通常灌注不良、破坏和渗漏，从而成为治疗和免疫细胞递送至肿瘤的障碍。此外，脉管系统可作为癌细胞转移以播种远处组织的管道，并促进?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Christopher Hughes博士实验室的成员对所述程序的宝贵投入，以及Abraham Lee博士实验室的合作者在平台设计和制造方面的帮助。这项工作得到了以下资助：UG3/UH3 TR002137、R61/R33 HL154307、1R01CA244571、1R01 HL149748、U54 CA217378 （CCWH） 和 TL1 TR001415 和 W81XWH2110393 （SJH）。
Materials
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
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