Établissement d’un modèle physiologique de micro-tumeurs vascularisées humaines pour la recherche sur le cancer
Summary
Ce protocole présente un modèle de tumeur sur puce physiologiquement pertinent pour effectuer des recherches fondamentales et translationnelles à haut débit sur le cancer humain, en faisant progresser le dépistage des médicaments, la modélisation des maladies et les approches de médecine personnalisée avec une description des procédures de chargement, d’entretien et d’évaluation.
Abstract
L’absence de modèles de cancer validés qui récapitulent le microenvironnement tumoral des cancers solides in vitro reste un goulot d’étranglement important pour la recherche préclinique sur le cancer et le développement thérapeutique. Pour surmonter ce problème, nous avons développé la microtumeur vascularisée (VMT), ou puce tumorale, un système microphysiologique qui modélise de manière réaliste le microenvironnement complexe de la tumeur humaine. La VMT se forme de novo au sein d’une plate-forme microfluidique par co-culture de plusieurs types de cellules humaines dans des conditions d’écoulement dynamiques et physiologiques. Cette construction micro-tumorale issue de l’ingénierie tissulaire intègre un réseau vasculaire perfusé vivant qui soutient la masse tumorale en croissance, tout comme les vaisseaux nouvellement formés le font in vivo. Il est important de noter que les médicaments et les cellules immunitaires doivent traverser la couche endothéliale pour atteindre la tumeur, modélisant in vivo les barrières physiologiques à l’administration et à l’efficacité thérapeutiques. Étant donné que la plate-forme VMT est optiquement transparente, l’imagerie haute résolution de processus dynamiques tels que l’extravasation des cellules immunitaires et les métastases peut être obtenue grâce à la visualisation directe des cellules marquées par fluorescence dans le tissu. De plus, le VMT conserve l’hétérogénéité tumorale in vivo , les signatures d’expression génique et les réponses médicamenteuses. Pratiquement n’importe quel type de tumeur peut être adapté à la plate-forme, et les cellules primaires de tissus chirurgicaux frais se développent et répondent au traitement médicamenteux dans le VMT, ouvrant la voie à une médecine véritablement personnalisée. Ici, les méthodes d’établissement de la VMT et de son utilisation pour la recherche en oncologie sont décrites. Cette approche novatrice ouvre de nouvelles possibilités pour l’étude des tumeurs et des réponses aux médicaments, offrant aux chercheurs un outil puissant pour faire avancer la recherche sur le cancer.
Introduction
Le cancer reste un problème de santé majeur dans le monde et est la deuxième cause de décès aux États-Unis. Pour la seule année 2023, le National Center for Health Statistics prévoit plus de 1,9 million de nouveaux cas de cancer et plus de 600 000 décès par cancer aux États-Unis1, soulignant le besoin urgent d’approches thérapeutiques efficaces. Cependant, à l’heure actuelle, seulement 5,1 % des traitements anticancéreux entrant dans les essais cliniques obtiennent finalement l’approbation de la FDA. L’échec des candidats prometteurs à progresser avec succès dans les essais cliniques peut être en partie attribué à l’utilisation de systèmes modèles non physiologiques, tels que les cultures 2D et sphéroïdales, lors du développement préclinique de médicaments2. Ces modèles classiques de cancer manquent de composants essentiels du microenvironnement tumoral, tels qu’une niche stromale, des cellules immunitaires associées et une vascularisation perfusée, qui sont des déterminants clés de la résistance thérapeutique et de la progression de la maladie. Ainsi, un nouveau système modèle qui imite mieux le microenvironnement tumoral humain in vivo est nécessaire pour améliorer la traduction clinique des résultats précliniques.
Le domaine de l’ingénierie tissulaire progresse rapidement, offrant des méthodes améliorées pour étudier les maladies humaines en laboratoire. L’un des développements importants est l’émergence des systèmes microphysiologiques (MPS), également connus sous le nom de puces d’organes ou de puces tissulaires, qui sont des organes humains miniaturisés fonctionnels capables de reproduire des conditions saines ou malades 3,4,5. Dans ce contexte, des puces tumorales, qui sont des modèles tridimensionnels de tumeurs humaines in vitro basées sur la microfluidique, ont été développées pour la recherche en oncologie 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Ces modèles avancés intègrent des signaux biochimiques et biophysiques dans un microenvironnement tumoral dynamique, ce qui permet aux chercheurs d’étudier le comportement des tumeurs et les réponses aux traitements dans un contexte plus pertinent sur le plan physiologique. Cependant, malgré ces progrès, peu de groupes ont réussi à intégrer un système vasculaire vivant et fonctionnel, en particulier un système qui s’auto-modèle en réponse au flux physiologique 3,4,5,6. L’inclusion d’un réseau vasculaire fonctionnel est cruciale car elle permet de modéliser les barrières physiques qui affectent l’administration de médicaments ou de cellules, l’ancrage des cellules dans des microenvironnements distincts et la migration transendothéliale des cellules tumorales, stromales et immunitaires. En incluant cette caractéristique, la puce tumorale peut mieux représenter les complexités observées dans le microenvironnement tumoral in vivo.
Pour répondre à ce besoin non satisfait, nous avons développé une nouvelle plateforme de criblage de médicaments qui permet de former des réseaux de micro-vaisseaux au sein d’un dispositif microfluidique 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Cette plate-forme de puce d’organe de base, appelée micro-organe vascularisé (VMO), peut être adaptée à pratiquement n’importe quel système d’organes pour reproduire la physiologie tissulaire d’origine pour la modélisation des maladies, le dépistage de médicaments et les applications de médecine personnalisée. Les VMO sont établis par la co-culture de cellules endothéliales dérivées de colonies endothéliales (ECFC-EC), HUVEC ou iPSC-EC (ci-après EC), et de multiples cellules stromales dans la chambre, y compris les fibroblastes pulmonaires humains normaux (NHLF), qui remodèlent la matrice, et les péricytes qui enveloppent et stabilisent les vaisseaux. Le VMO peut également être établi en tant que système modèle de cancer en co-cultivant des cellules tumorales avec le stroma associé pour créer un modèle de micro-tumeur vascularisée (VMT)8,9,10,11,12,13, ou puce tumorale. Grâce à la co-culture de plusieurs types de cellules dans un environnement d’écoulement dynamique, des réseaux microvasculaires perfusés se forment de novo dans les chambres tissulaires du dispositif, où la vasculogenèse est étroitement régulée par les débits interstitiels14,15. Le milieu est conduit à travers les canaux microfluidiques de l’appareil par une tête de pression hydrostatique qui alimente les cellules environnantes de la chambre tissulaire en nutriments exclusivement à travers les micro-vaisseaux, avec un coefficient de perméabilité de 1,2 x 10-7 cm/s, similaire à ce que l’on observe pour les capillaires in vivo8.
L’incorporation de micro-vaisseaux auto-organisés dans le modèle VMT représente une percée significative car elle : 1) imite la structure et la fonction des masses tumorales vascularisées in vivo ; 2) peut modéliser les étapes clés des métastases, y compris les interactions tumeur-endothélial et les cellules stromales ; 3) établit des barrières physiologiquement sélectives pour l’administration de nutriments et de médicaments, améliorant ainsi le dépistage pharmaceutique ; et 4) permet l’évaluation directe des médicaments ayant des capacités anti-angiogéniques et anti-métastatiques. En reproduisant l’administration in vivo de nutriments, de médicaments et de cellules immunitaires dans un microenvironnement 3D complexe, la plateforme VMO/VMT est un modèle physiologiquement pertinent qui peut être utilisé pour effectuer le criblage de médicaments et étudier la biologie du cancer, vasculaire ou spécifique à un organe. Il est important de noter que le VMT favorise la croissance de divers types de tumeurs, notamment le cancer du côlon, le mélanome, le cancer du sein, le glioblastome, le cancer du poumon, la carcinose péritonéale, le cancer de l’ovaire et le cancer du pancréas 8,9,10,11,12,13. En plus d’être peu coûteuse, facile à établir et adaptée aux expériences à haut débit, la plateforme microfluidique est entièrement compatible optiquement pour l’analyse d’images en temps réel des interactions tumeur-stromal et de la réponse à des stimuli ou à des traitements. Chaque type de cellule du système est étiqueté avec un marqueur fluorescent différent pour permettre une visualisation directe et un suivi du comportement cellulaire tout au long de l’expérience, créant ainsi une fenêtre sur le microenvironnement dynamique de la tumeur. Nous avons précédemment montré que le VMT modélise plus fidèlement la croissance tumorale in vivo, l’architecture, l’hétérogénéité, les signatures d’expression génique et les réponses médicamenteuses que les modalités de culture standard10. Il est important de noter que le VMT soutient la croissance et l’étude des cellules dérivées des patients, y compris les cellules cancéreuses, ce qui modélise mieux la pathologie des tumeurs parentes que les cultures sphéroïdes standard et fait progresser les efforts de médecine personnalisée11. Ce manuscrit décrit les méthodes d’établissement de la VMT, en démontrant son utilité pour l’étude des cancers humains.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presque tous les tissus du corps reçoivent des nutriments et de l’oxygène par le biais du système vasculaire, ce qui en fait un élément essentiel pour la modélisation réaliste des maladies et le dépistage des médicaments in vitro. De plus, plusieurs tumeurs malignes et états pathologiques sont définis par un dysfonctionnement de l’endothélium vasculaire et une hyperperméabilité3. Notamment, dans le cancer, la vascularisation associée à la tumeur est souvent mal perfus?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire du Dr Christopher Hughes pour leur précieuse contribution aux procédures décrites, ainsi que nos collaborateurs du laboratoire du Dr Abraham Lee pour leur aide dans la conception et la fabrication de la plateforme. Ces travaux ont été financés par les subventions suivantes : UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) et TL1 TR001415 et W81XWH2110393 (SJH).
Materials
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
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