Etablierung eines physiologischen humanen vaskularisierten Mikrotumormodells für die Krebsforschung

Summary

Dieses Protokoll stellt ein physiologisch relevantes Tumor-on-a-Chip-Modell vor, um Hochdurchsatz-Grundlagen- und translationale Krebsforschung am Menschen durchzuführen und das Arzneimittel-Screening, die Krankheitsmodellierung und Ansätze der personalisierten Medizin mit einer Beschreibung von Lade-, Wartungs- und Bewertungsverfahren voranzutreiben.

Abstract

Der Mangel an validierten Krebsmodellen, die die Tumormikroumgebung solider Krebsarten in vitro rekapitulieren, stellt nach wie vor einen erheblichen Engpass für die präklinische Krebsforschung und die therapeutische Entwicklung dar. Um dieses Problem zu lösen, haben wir den vaskularisierten Mikrotumor (VMT) oder Tumorchip entwickelt, ein mikrophysiologisches System, das die komplexe Mikroumgebung des menschlichen Tumors realistisch modelliert. Die VMT bildet sich de novo innerhalb einer mikrofluidischen Plattform durch Co-Kultur mehrerer humaner Zelltypen unter dynamischen, physiologischen Strömungsbedingungen. Dieses Gewebe-Engineering-Mikrotumor-Konstrukt enthält ein lebendes, durchblutetes Gefäßnetzwerk, das die wachsende Tumormasse genauso unterstützt, wie es neu gebildete Gefäße in vivo tun. Wichtig ist, dass Medikamente und Immunzellen die Endothelschicht überwinden müssen, um den Tumor zu erreichen, wodurch physiologische Barrieren für die therapeutische Verabreichung und Wirksamkeit in vivo modelliert werden. Da die VMT-Plattform optisch transparent ist, kann eine hochauflösende Bildgebung dynamischer Prozesse wie Immunzellextravasation und Metastasierung mit direkter Visualisierung von fluoreszenzmarkierten Zellen innerhalb des Gewebes erreicht werden. Darüber hinaus behält die VMT in vivo die Tumorheterogenität, die Genexpressionssignaturen und das Ansprechen auf Medikamente bei. Praktisch jeder Tumortyp kann an die Plattform angepasst werden, und Primärzellen aus frischem chirurgischem Gewebe wachsen und sprechen auf die medikamentöse Behandlung in der VMT an, was den Weg zu einer wirklich personalisierten Medizin ebnet. Hier werden die Methoden zur Etablierung des VMT und dessen Nutzung für die onkologische Forschung skizziert. Dieser innovative Ansatz eröffnet neue Möglichkeiten für die Untersuchung von Tumoren und Arzneimittelreaktionen und gibt Forschern ein leistungsfähiges Werkzeug an die Hand, um die Krebsforschung voranzutreiben.

Introduction

Krebs ist nach wie vor ein großes Gesundheitsproblem weltweit und die zweithäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten. Allein für das Jahr 2023 rechnet das National Center for Health Statistics mit mehr als 1,9 Millionen neuen Krebsfällen und über 600.000 Krebstodesfällen in den USA¹, was den dringenden Bedarf an wirksamen Behandlungsansätzen unterstreicht. Derzeit erhalten jedoch nur 5,1 % der Krebstherapeutika, die sich in klinischen Studien befinden, letztendlich eine FDA-Zulassung. Das Scheitern vielversprechender Kandidaten, klinische Studien erfolgreich zu durchlaufen, kann teilweise auf die Verwendung nicht-physiologischer Modellsysteme wie 2D- und Sphäroidkulturen während der präklinischen Arzneimittelentwicklung zurückgeführt werden². Diesen klassischen Krebsmodellen fehlen wesentliche Komponenten der Tumormikroumgebung, wie z. B. eine stromale Nische, assoziierte Immunzellen und durchblutete Gefäße, die wichtige Determinanten der therapeutischen Resistenz und des Fortschreitens der Krankheit sind. Daher ist ein neues Modellsystem notwendig, das die menschliche in vivo Tumormikroumgebung besser nachahmt, um die klinische Translation präklinischer Befunde zu verbessern.

Das Gebiet des Tissue Engineering schreitet rasant voran und bietet verbesserte Methoden zur Untersuchung menschlicher Krankheiten im Labor. Eine wichtige Entwicklung ist das Aufkommen mikrophysiologischer Systeme (MPS), auch bekannt als Organchips oder Gewebechips, bei denen es sich um funktionelle, miniaturisierte menschliche Organe handelt, die in der Lage sind, gesunde oder kranke Zustände zu replizieren ^3,4,5. In diesem Zusammenhang wurden für die onkologische Forschung Tumorchips, d.h. dreidimensionale mikrofluidikbasierte in vitro humane Tumormodelle, entwickelt 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Diese fortschrittlichen Modelle enthalten biochemische und biophysikalische Hinweise in einer dynamischen Tumormikroumgebung und ermöglichen es den Forschern, das Verhalten von Tumoren und das Ansprechen auf Behandlungen in einem physiologisch relevanteren Kontext zu untersuchen. Trotz dieser Fortschritte haben jedoch nur wenige Gruppen erfolgreich ein lebendes, funktionelles Gefäßsystem integriert, insbesondere eines, das sich als Reaktion auf den physiologischen Fluss selbst mustert 3,4,5,6. Die Einbeziehung eines funktionellen vaskulären Netzwerks ist von entscheidender Bedeutung, da es die Modellierung physikalischer Barrieren ermöglicht, die die Verabreichung von Medikamenten oder Zellen, das Homing von Zellen in bestimmte Mikroumgebungen und die transendotheliale Migration von Tumor-, Stroma- und Immunzellen beeinflussen. Durch die Einbeziehung dieses Merkmals kann der Tumorchip die Komplexität, die in der In-vivo-Tumormikroumgebung beobachtet wird, besser darstellen.

Um diesen ungedeckten Bedarf zu decken, haben wir eine neuartige Wirkstoff-Screening-Plattform entwickelt, die es ermöglicht, Mikrogefäßnetzwerke innerhalb eines mikrofluidischen Geräts^{zu bilden} 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Diese Basis-Organchip-Plattform, die als vaskularisiertes Mikroorgan (VMO) bezeichnet wird, kann an praktisch jedes Organsystem angepasst werden, um die ursprüngliche Gewebephysiologie für die Krankheitsmodellierung, das Arzneimittelscreening und Anwendungen der personalisierten Medizin zu replizieren. VMOs werden durch die Co-Kultivierung von endothelialen koloniebildenden zellabgeleiteten Endothelzellen (ECFC-EC), HUVEC oder iPSC-EC (im Folgenden EC) und mehreren Stromazellen in der Kammer etabliert, einschließlich normaler menschlicher Lungenfibroblasten (NHLF), die die Matrix umbauen, und Perizyten, die die Gefäße umhüllen und stabilisieren. Das VMO kann auch als Krebsmodellsystem etabliert werden, indem Tumorzellen mit dem zugehörigen Stroma kokultiviert werden, um einen vaskularisierten Mikrotumor (VMT)^{8,9,10,11,12,13} oder ein Tumorchip-Modell zu erstellen. Durch die Co-Kultur mehrerer Zelltypen in einer dynamischen Flussumgebung bilden perfundierte mikrovaskuläre Netzwerke de novo in den Gewebekammern des Geräts, wo die Vaskulogenese durch interstitielle Flussraten eng reguliert wird^14,15. Das Medium wird durch einen hydrostatischen Druckkopf durch die mikrofluidischen Kanäle des Geräts getrieben, der die umgebenden Zellen der Gewebekammer ausschließlich über die Mikrogefäße mit Nährstoffen versorgt, mit einem Permeabilitätskoeffizienten von 1,2 x ^10-7 cm/s, ähnlich wie bei Kapillaren in vivo⁸.

Die Integration von selbstorganisierenden Mikrogefäßen in das VMT-Modell stellt einen bedeutenden Durchbruch dar, da es: 1) die Struktur und Funktion vaskularisierter Tumormassen in vivo nachahmt; 2) kann Schlüsselschritte der Metastasierung modellieren, einschließlich Tumor-Endothel- und Stromazell-Interaktionen; 3) etabliert physiologisch selektive Barrieren für die Nährstoff- und Arzneimittelabgabe und verbessert so das pharmazeutische Screening; und 4) ermöglicht die direkte Bewertung von Medikamenten mit anti-angiogenen und anti-metastasierenden Eigenschaften. Durch die Replikation der In-vivo-Verabreichung von Nährstoffen, Medikamenten und Immunzellen in einer komplexen 3D-Mikroumgebung ist die VMO/VMT-Plattform ein physiologisch relevantes Modell, das zur Durchführung von Wirkstoff-Screenings und zur Untersuchung der Krebs-, Gefäß- oder organspezifischen Biologie verwendet werden kann. Wichtig ist, dass die VMT das Wachstum verschiedener Arten von Tumoren unterstützt, darunter Dickdarmkrebs, Melanom, Brustkrebs, Glioblastom, Lungenkrebs, Peritonealkarzinose, Eierstockkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs 8,9,10,11,12,13. Die mikrofluidische Plattform ist nicht nur kostengünstig, einfach einzurichten und für Hochdurchsatzexperimente geeignet, sondern auch optisch vollständig kompatibel für die Echtzeit-Bildanalyse von Tumor-Stroma-Interaktionen und die Reaktion auf Stimuli oder Therapeutika. Jeder Zelltyp im System ist mit einem anderen Fluoreszenzmarker markiert, um eine direkte Visualisierung und Verfolgung des Zellverhaltens während des gesamten Experiments zu ermöglichen und ein Fenster in die dynamische Tumormikroumgebung zu schaffen. Wir haben bereits gezeigt, dass die VMT das Wachstum, die Architektur, die Heterogenität, die Genexpressionssignaturen und das Ansprechen von Medikamenten in vivo genauer modelliert als Standardkulturmodalitäten¹⁰. Wichtig ist, dass die VMT das Wachstum und die Untersuchung von Patientenzellen, einschließlich Krebszellen, unterstützt, die die Pathologie der Elterntumoren besser modellieren als Standard-Sphäroidkulturen und die Bemühungen um personalisierte Medizin weiter vorantreiben¹¹. Dieses Manuskript skizziert die Methoden zur Etablierung des VMT und zeigt seinen Nutzen für die Untersuchung menschlicher Krebserkrankungen.

Protocol

1. Design und Herstellung Geräte-DesignFür die Herstellung von mikrofluidischen Geräten wird eine SU-8-Form mit einer 200-μm-Schicht aus SU-8 hergestellt, die auf einen Si-Wafer aufgetragen wird (RCA-1 gereinigt und mit 2 % Fluorwasserstoff (HF) behandelt), gefolgt von einem Photolithographieschritt mit einer einzigen Maske, wie zuvor beschrieben 8,9. Gießen Sie eine 4 mm dicke Polydimethylsiloxan (PDMS)-Replik a…

Representative Results

Gemäß den hier beschriebenen Protokollen wurden VMOs und VMTs unter Verwendung von kommerziell erworbenen EC-, NHLF- und für VMT der triple-negativen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 etabliert. Etablierte VMOs wurden auch mit Krebszellen durchblutet, um die Metastasierung nachzuahmen. In jedem Modell bildet sich an Tag 5 der Co-Kultur ein vaskuläres Netzwerk als Reaktion auf die schwerkraftgetriebene Strömung durch die Gewebekammer selbst und dient als Kanal für die In-vivo-artige Abgabe von Nährstoffen, Th…

Discussion

Fast jedes Gewebe im Körper erhält Nährstoffe und Sauerstoff über das Gefäßsystem, was es zu einer kritischen Komponente für eine realistische Krankheitsmodellierung und ein Arzneimittelscreening in vitro macht. Darüber hinaus werden verschiedene Malignome und Krankheitszustände durch vaskuläre endotheliale Dysfunktion und Hyperpermeabilität definiert³. Bemerkenswert ist, dass bei Krebs das tumorassoziierte Gefäßsystem oft schlecht durchblutet, gestört und undicht ist, was a…

Materials

Fabrication
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95%	Sigma-Aldrich	175617-100G
Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates	Greiner Bio-One	655096
Methanol ≥99.8% ACS	VWR Chemicals BDH	BDH1135-1LP
MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter,	Integra Miltex	33-31AA-P/25
PDMS membrane	PAX Industries	HT-6240
Plasma Cleaner PDC-001	Harrick Plasma	N/A
Smooth-Cast 385	Smooth-On	N/A
SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator	Bel-Art	F42400-4031
Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate	VWR	82050-827
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow	4019862
Cell culture/Loading
BioTek Lionheart FX Automated Microscope	Agilent	CYT5MFAW
CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells	StemBioSys	N/A
Collagen I, rat tail	Enzo Life Sciences
Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4)	Sigma-Aldrich	C5138
Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium	Corning	21-021-CV
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	10013CV
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fibrinogen from bovine plasma	Neta Scientific	SIAL-341573
Fibronectin human plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa)	Sigma-Aldrich	FD70S-1G
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Hyaluronidase from sheep testes (type 4)	Sigma-Aldrich	H6254
Laminin Mouse Protein	Gibco	23017015
Leica TCS SP8	Leica	N/A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts	Lonza	CC-2512
Nikon Eclipse Ti	Nikon	N/A
Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	15735-90-1L
PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells	Lonza	CC-2702
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Avantor Seradigm	97068-091
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144
Quick-RNA Microprep Kit	Zymo Research	R1051
Thrombin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	T4648
Triton X-100 (Electrophoresis),	Fisher BioReagents	BP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Gibco	12605028
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Vasculife	Lifeline Cell Technology	LL-0003