Creazione di un modello fisiologico di microtumore vascolarizzato umano per la ricerca sul cancro
Summary
Questo protocollo presenta un modello tumore-on-a-chip fisiologicamente rilevante per eseguire ricerche di base e traslazionali sul cancro umano ad alto rendimento, facendo progredire lo screening dei farmaci, la modellazione delle malattie e gli approcci di medicina personalizzata con una descrizione delle procedure di carico, manutenzione e valutazione.
Abstract
La mancanza di modelli tumorali convalidati che ricapitolino il microambiente tumorale dei tumori solidi in vitro rimane un collo di bottiglia significativo per la ricerca preclinica sul cancro e lo sviluppo terapeutico. Per ovviare a questo problema, abbiamo sviluppato il microtumore vascolarizzato (VMT), o chip tumorale, un sistema microfisiologico che modella realisticamente il complesso microambiente tumorale umano. Il VMT si forma de novo all’interno di una piattaforma microfluidica mediante co-coltura di più tipi di cellule umane in condizioni di flusso dinamico e fisiologico. Questo costrutto microtumorale di ingegneria tissutale incorpora una rete vascolare perfusa vivente che supporta la massa tumorale in crescita proprio come fanno i vasi neoformati in vivo. È importante sottolineare che i farmaci e le cellule immunitarie devono attraversare lo strato endoteliale per raggiungere il tumore, modellando in vivo le barriere fisiologiche alla somministrazione e all’efficacia terapeutica. Poiché la piattaforma VMT è otticamente trasparente, è possibile ottenere l’imaging ad alta risoluzione di processi dinamici come lo stravaso di cellule immunitarie e le metastasi con la visualizzazione diretta delle cellule marcate con fluorescenza all’interno del tessuto. Inoltre, il VMT mantiene l’eterogeneità tumorale in vivo , le firme di espressione genica e le risposte ai farmaci. Praticamente qualsiasi tipo di tumore può essere adattato alla piattaforma e le cellule primarie dei tessuti chirurgici freschi crescono e rispondono al trattamento farmacologico nella VMT, aprendo la strada a una medicina veramente personalizzata. Qui vengono delineati i metodi per stabilire la VMT e utilizzarla per la ricerca oncologica. Questo approccio innovativo apre nuove possibilità per lo studio dei tumori e delle risposte ai farmaci, fornendo ai ricercatori un potente strumento per far progredire la ricerca sul cancro.
Introduction
Il cancro rimane una delle principali preoccupazioni per la salute in tutto il mondo ed è la seconda causa di morte negli Stati Uniti. Solo per l’anno 2023, il National Center for Health Statistics prevede più di 1,9 milioni di nuovi casi di cancro e oltre 600.000 decessi per cancro negli Stati Uniti1, evidenziando l’urgente necessità di approcci terapeutici efficaci. Tuttavia, attualmente, solo il 5,1% delle terapie antitumorali che entrano negli studi clinici alla fine ottiene l’approvazione della FDA. L’incapacità dei candidati promettenti di progredire con successo negli studi clinici può essere in parte attribuita all’uso di sistemi modello non fisiologici, come colture 2D e sferoidi, durante lo sviluppo preclinicodel farmaco 2. Questi modelli di cancro classici mancano di componenti essenziali del microambiente tumorale, come una nicchia stromale, cellule immunitarie associate e vascolarizzazione perfusa, che sono determinanti chiave della resistenza terapeutica e della progressione della malattia. Pertanto, è necessario un nuovo sistema modello che imita meglio il microambiente tumorale umano in vivo per migliorare la traduzione clinica dei risultati preclinici.
Il campo dell’ingegneria tissutale sta progredendo rapidamente, fornendo metodi migliorati per lo studio delle malattie umane in laboratorio. Uno sviluppo significativo è l’emergere di sistemi microfisiologici (MPS), noti anche come chip d’organo o chip tissutali, che sono organi umani funzionali e miniaturizzati in grado di replicare condizioni sane o malate 3,4,5. In questo contesto, sono stati sviluppati chip tumorali, che sono modelli tumorali umani in vitro basati sulla microfluidica tridimensionale, per la ricerca oncologica 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Questi modelli avanzati incorporano segnali biochimici e biofisici all’interno di un microambiente tumorale dinamico, consentendo ai ricercatori di studiare il comportamento del tumore e le risposte ai trattamenti in un contesto fisiologicamente più rilevante. Tuttavia, nonostante questi progressi, pochi gruppi hanno incorporato con successo una vascolarizzazione funzionale vivente, in particolare uno che si auto-modella in risposta al flusso fisiologico 3,4,5,6. L’inclusione di una rete vascolare funzionale è fondamentale in quanto consente di modellare le barriere fisiche che influenzano la somministrazione di farmaci o cellule, l’homing cellulare in microambienti distinti e la migrazione transendoteliale di cellule tumorali, stromali e immunitarie. Includendo questa caratteristica, il chip tumorale può rappresentare meglio le complessità osservate nel microambiente tumorale in vivo.
Per rispondere a questa esigenza insoddisfatta, abbiamo sviluppato una nuova piattaforma di screening farmacologico che consente la formazione di reti di microvasi all’interno di un dispositivo microfluidico 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Questa piattaforma di chip per organi di base, denominata microorgano vascolarizzato (VMO), può essere adattata praticamente a qualsiasi sistema di organi per replicare la fisiologia tissutale originale per la modellazione di malattie, lo screening di farmaci e le applicazioni di medicina personalizzata. I VMO sono stabiliti co-coltivando cellule endoteliali derivate da cellule (ECFC-EC), HUVEC o iPSC-EC (di seguito EC) e più cellule stromali nella camera, compresi i normali fibroblasti polmonari umani (NHLF), che rimodellano la matrice, e i periciti che avvolgono e stabilizzano i vasi. Il VMO può anche essere stabilito come sistema modello di cancro co-coltivando le cellule tumorali con lo stroma associato per creare un micro-tumore vascolarizzato (VMT)8,9,10,11,12,13, o modello di chip tumorale. Attraverso la co-coltura di più tipi cellulari in un ambiente di flusso dinamico, reti microvascolari perfuse si formano de novo nelle camere tissutali del dispositivo, dove la vasculogenesi è strettamente regolata da velocità di flusso interstiziale14,15. Il fluido viene guidato attraverso i canali microfluidici del dispositivo da una testa di pressione idrostatica che fornisce alle cellule circostanti della camera tissutale i nutrienti esclusivamente attraverso i micro-vasi, con un coefficiente di permeabilità di 1,2 x 10-7 cm/s, simile a quello osservato per i capillari in vivo8.
L’incorporazione di micro-vasi auto-organizzanti nel modello VMT rappresenta un significativo passo avanti perché: 1) imita la struttura e la funzione delle masse tumorali vascolarizzate in vivo; 2) è in grado di modellare le fasi chiave delle metastasi, comprese le interazioni tumore-endoteliale e delle cellule stromali; 3) stabilisce barriere fisiologicamente selettive per la somministrazione di nutrienti e farmaci, migliorando lo screening farmaceutico; e 4) consente la valutazione diretta di farmaci con capacità anti-angiogeniche e anti-metastatiche. Replicando la somministrazione in vivo di nutrienti, farmaci e cellule immunitarie in un complesso microambiente 3D, la piattaforma VMO/VMT è un modello fisiologicamente rilevante che può essere utilizzato per eseguire screening farmacologici e studiare il cancro, la biologia vascolare o organo-specifica. È importante sottolineare che il VMT supporta la crescita di vari tipi di tumori, tra cui il cancro del colon, il melanoma, il cancro al seno, il glioblastoma, il cancro ai polmoni, la carcinosi peritoneale, il cancro ovarico e il cancro al pancreas 8,9,10,11,12,13. Oltre ad essere a basso costo, facilmente stabilibile e disponibile per esperimenti ad alto rendimento, la piattaforma microfluidica è completamente compatibile otticamente per l’analisi delle immagini in tempo reale delle interazioni tumore-stromali e della risposta a stimoli o terapie. Ogni tipo di cellula nel sistema è etichettato con un diverso marcatore fluorescente per consentire la visualizzazione diretta e il monitoraggio del comportamento cellulare durante l’intero esperimento, creando una finestra sul microambiente dinamico del tumore. Abbiamo precedentemente dimostrato che la VMT modella più fedelmente in vivo la crescita, l’architettura, l’eterogeneità, le firme di espressione genica e le risposte ai farmaci rispetto alle modalità di coltura standard10. È importante sottolineare che il VMT supporta la crescita e lo studio di cellule derivate dal paziente, comprese le cellule tumorali, che modellano meglio la patologia dei tumori genitori rispetto alle colture di sferoidi standard e fanno progredire ulteriormente gli sforzi di medicina personalizzata11. Questo manoscritto delinea i metodi per stabilire la VMT, mostrando la sua utilità per lo studio dei tumori umani.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quasi tutti i tessuti del corpo ricevono sostanze nutritive e ossigeno attraverso la vascolarizzazione, rendendolo un componente fondamentale per la modellazione realistica delle malattie e lo screening dei farmaci in vitro. Inoltre, diverse neoplasie maligne e stati patologici sono definiti dalla disfunzione endoteliale vascolare e dall’iperpermeabilità3. In particolare, nel cancro, la vascolarizzazione associata al tumore è spesso mal perfusa, interrotta e permeabile, agendo così com…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio del Dr. Christopher Hughes per il loro prezioso contributo alle procedure descritte, così come i nostri collaboratori del laboratorio del Dr. Abraham Lee per la loro assistenza nella progettazione e fabbricazione della piattaforma. Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) e TL1 TR001415 e W81XWH2110393 (SJH).
Materials
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
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