Etablering av en fysiologisk human vaskulariserad mikrotumörmodell för cancerforskning
Summary
Detta protokoll presenterar en fysiologiskt relevant tumör-på-en-chip-modell för att utföra grundläggande och translationell cancerforskning på människor med hög genomströmning, främja läkemedelsscreening, sjukdomsmodellering och personliga medicinska metoder med en beskrivning av laddnings-, underhålls- och utvärderingsprocedurer.
Abstract
Bristen på validerade cancermodeller som rekapitulerar tumörmikromiljön i solida cancerformer in vitro är fortfarande en betydande flaskhals för preklinisk cancerforskning och terapeutisk utveckling. För att övervinna detta problem har vi utvecklat den vaskulariserade mikrotumören (VMT), eller tumörchipet, ett mikrofysiologiskt system som realistiskt modellerar den komplexa mänskliga tumörmikromiljön. VMT bildas de novo inom en mikrofluidisk plattform genom samodling av flera humana celltyper under dynamiska, fysiologiska flödesförhållanden. Denna vävnadskonstruerade mikrotumörkonstruktion innehåller ett levande perfunderat vaskulärt nätverk som stöder den växande tumörmassan precis som nybildade kärl gör in vivo. Det är viktigt att läkemedel och immunceller måste passera endotelskiktet för att nå tumören, vilket modellerar in vivo fysiologiska hinder för terapeutisk leverans och effekt. Eftersom VMT-plattformen är optiskt transparent kan högupplöst avbildning av dynamiska processer som immuncellsextravasering och metastasering uppnås med direkt visualisering av fluorescerande märkta celler i vävnaden. Vidare bibehåller VMT in vivo tumörheterogenitet, genuttryckssignaturer och läkemedelssvar. Praktiskt taget alla tumörtyper kan anpassas till plattformen, och primära celler från färsk kirurgisk vävnad växer och svarar på läkemedelsbehandling i VMT, vilket banar väg för verkligt personlig medicin. Här beskrivs metoderna för att etablera VMT och använda den för onkologisk forskning. Detta innovativa tillvägagångssätt öppnar nya möjligheter för att studera tumörer och läkemedelssvar, vilket ger forskare ett kraftfullt verktyg för att främja cancerforskning.
Introduction
Cancer är fortfarande ett stort hälsoproblem över hela världen och är den näst vanligaste dödsorsaken i USA. Bara för år 2023 räknar National Center for Health Statistics med att mer än 1,9 miljoner nya cancerfall och över 600 000 cancerdödsfall kommer att inträffa i USA1, vilket belyser det akuta behovet av effektiva behandlingsmetoder. Men för närvarande är det bara 5,1 % av de cancerläkemedel som går in i kliniska prövningar som slutligen får FDA-godkännande. Att lovande kandidater inte lyckats ta sig igenom kliniska prövningar kan delvis tillskrivas användningen av icke-fysiologiska modellsystem, såsom 2D- och sfäroidkulturer, under preklinisk läkemedelsutveckling2. Dessa klassiska cancermodeller saknar väsentliga komponenter i tumörens mikromiljö, såsom en stromanisch, associerade immunceller och perfunderad vaskulatur, som är viktiga bestämningsfaktorer för terapeutisk resistens och sjukdomsprogression. Således är ett nytt modellsystem som bättre efterliknar den mänskliga in vivo tumörmikromiljön nödvändig för att förbättra den kliniska översättningen av prekliniska fynd.
Området vävnadsteknik går snabbt framåt, vilket ger förbättrade metoder för att studera mänskliga sjukdomar i laboratoriemiljöer. En viktig utveckling är framväxten av mikrofysiologiska system (MPS), även kända som organchips eller vävnadschips, som är funktionella, miniatyriserade mänskliga organ som kan replikera friska eller sjuka tillstånd 3,4,5. Inom detta sammanhang har tumörchips, som är tredimensionella mikrofluidikbaserade in vitro-modeller av mänskliga tumörer, utvecklats för onkologisk forskning 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Dessa avancerade modeller införlivar biokemiska och biofysiska signaler i en dynamisk tumörmikromiljö, vilket gör det möjligt för forskare att studera tumörbeteende och svar på behandlingar i ett mer fysiologiskt relevant sammanhang. Men trots dessa framsteg är det få grupper som framgångsrikt har införlivat en levande, funktionell vaskulatur, särskilt en som självmönster som svar på fysiologiskt flöde 3,4,5,6. Inkluderingen av ett funktionellt vaskulärt nätverk är avgörande eftersom det möjliggör modellering av fysiska barriärer som påverkar läkemedels- eller cellleverans, cellhoming till distinkta mikromiljöer och transendotelmigration av tumör-, stroma- och immunceller. Genom att inkludera denna funktion kan tumörchipet bättre representera den komplexitet som observerats i tumörmikromiljön in vivo.
För att möta detta ouppfyllda behov har vi utvecklat en ny plattform för läkemedelsscreening som gör det möjligt för mikrokärlsnätverk att bildas i en mikrofluidisk enhet 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Denna basplattform för organchip, kallad vaskulariserade mikroorgan (VMO), kan anpassas till praktiskt taget alla organsystem för att replikera den ursprungliga vävnadsfysiologin för sjukdomsmodellering, läkemedelsscreening och personliga medicinska tillämpningar. VMO etableras genom samodling av endotelkolonibildande cellhärledda endotelceller (ECFC-EC), HUVEC eller iPSC-EC (hädanefter EC) och flera stromaceller i kammaren, inklusive normala humana lungfibroblaster (NHLF), som omformar matrisen, och pericyter som omsluter och stabiliserar kärlen. VMO kan också etableras som ett cancermodellsystem genom att samodla tumörceller med tillhörande stromat för att skapa en vaskulariserad mikrotumör (VMT)8,9,10,11,12,13, eller tumörchip, modell. Genom samodling av flera celltyper i en dynamisk flödesmiljö bildas perfunderade mikrovaskulära nätverk de novo i enhetens vävnadskamrar, där vaskulogenesen regleras noggrant av interstitiella flödeshastigheter14,15. Mediet drivs genom anordningens mikrofluidiska kanaler av ett hydrostatiskt tryckhuvud som förser de omgivande cellerna i vävnadskammaren med näringsämnen uteslutande genom mikrokärlen, med en permeabilitetskoefficient på 1,2 x 10-7 cm/s, liknande vad som ses för kapillärer in vivo8.
Inkorporeringen av självorganiserande mikrokärl i VMT-modellen representerar ett betydande genombrott eftersom den: 1) efterliknar strukturen och funktionen hos vaskulariserade tumörmassor in vivo; 2) kan modellera viktiga steg i metastaser, inklusive tumör-endotelial och stromacellsinteraktioner; 3) etablerar fysiologiskt selektiva barriärer för tillförsel av näringsämnen och läkemedel, vilket förbättrar läkemedelsscreeningen; och 4) möjliggör direkt bedömning av läkemedel med antiangiogena och antimetastaserande egenskaper. Genom att replikera in vivo-leverans av näringsämnen, läkemedel och immunceller i en komplex 3D-mikromiljö är VMO/VMT-plattformen en fysiologiskt relevant modell som kan användas för att utföra läkemedelsscreening och studera cancer-, kärl- eller organspecifik biologi. Viktigt är att VMT stöder tillväxten av olika typer av tumörer, inklusive tjocktarmscancer, melanom, bröstcancer, glioblastom, lungcancer, peritonealcancer, äggstockscancer och bukspottkörtelcancer 8,9,10,11,12,13. Förutom att vara billig, lätt att etablera och arrangerad för experiment med hög genomströmning, är mikrofluidikplattformen helt optiskt kompatibel för bildanalys i realtid av tumör-stroma-interaktioner och svar på stimuli eller terapier. Varje celltyp i systemet är märkt med en annan fluorescerande markör för att möjliggöra direkt visualisering och spårning av cellbeteende under hela experimentet, vilket skapar ett fönster in i den dynamiska tumörmikromiljön. Vi har tidigare visat att VMT mer troget modellerar in vivo tumörtillväxt, arkitektur, heterogenitet, genuttryckssignaturer och läkemedelssvar än standardodlingsmodaliteter10. Det är viktigt att VMT stöder tillväxt och studier av patienthärledda celler, inklusive cancerceller, som bättre modellerar modertumörernas patologi än vanliga sfäroidkulturer och ytterligare främjar insatser inom personlig medicin11. Detta manuskript beskriver metoderna för att etablera VMT och visar dess användbarhet för att studera mänskliga cancerformer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nästan varje vävnad i kroppen får näringsämnen och syre genom kärlen, vilket gör det till en kritisk komponent för realistisk sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening in vitro. Dessutom definieras flera maligniteter och sjukdomstillstånd av vaskulär endoteldysfunktion och hyperpermeabilitet3. Noterbart är att vid cancer är tumörassocierad vaskulatur ofta dåligt perfunderad, störd och läckande, vilket fungerar som en barriär för terapeutisk och immuncellsleverans till…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmarna i Dr. Christopher Hughes labb för deras värdefulla bidrag till de beskrivna procedurerna, liksom våra medarbetare i Dr. Abraham Lees labb för deras hjälp med plattformsdesign och tillverkning. Detta arbete har finansierats av följande anslag: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) och TL1 TR001415 och W81XWH2110393 (SJH).
Materials
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
- Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. Applications of tumor chip technology. Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).
- Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W. The vascular niche in next generation microphysiological systems. Lab Chip. 21 (17), 3615-3616 (2021).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Vascularized microfluidic organ-chips for drug screening, disease models and tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 52, 116-123 (2018).
- Shirure, V. S., Hughes, C. C. W., George, S. C. Engineering vascularized organoid-on-a-chip models. Annu Rev Biomed Eng. 23, 141-167 (2021).
- Del Piccolo, N., et al. Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis. Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798 (2021).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nat Rev Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Sci Rep. 6, 31589 (2016).
- Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
- Hachey, S. J., et al. An in vitro vascularized micro-tumor model of human colorectal cancer recapitulates in vivo responses to standard-of-care therapy. Lab Chip. 21 (7), 1333-1351 (2021).
- Hachey, S. J., et al. A Human Vascularized Micro-Tumor Model of Patient-Derived Colorectal Cancer Recapitulates Clinical Disease. Transl Res. 255, 97-108 (2023).
- Liu, Y., et al. Human in vitro vascularized micro-organ and micro-tumor models are reproducible organ-on-a-chip platforms for studies of anticancer drugs. Toxicology. 445, 152601 (2020).
- Jahid, S., et al. Structure-based Design of CDC42 Effector Interaction Inhibitors for the Treatment of Cancer. Cell Rep. 39 (4), 110760 (2022).
- Hsu, Y. H., Moya, M. L., Hughes, C. C. W., George, S. C., Lee, A. P. A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological vascularized tissue arrays. Lab Chip. 13 (15), 2990-2998 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Christopher, C. W. H., George, S. C. In vitro perfused human capillary networks. Tissue Eng – Part C: Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Wang, X., et al. An on-chip microfluidic pressure regulator that facilitates reproducible loading of cells and hydrogels into microphysiological system platforms. Lab Chip. 16 (5), 868-876 (2016).
- Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Exp Biol Med. 242 (17), 1669-1678 (2017).
- Kurokawa, Y. K., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells for three-dimensional microphysiological systems. Tissue Eng Part C: Methods. 23 (8), 474-484 (2017).
- Romero-López, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS one. 6 (11), e27385 (2011).
- Corliss, B. A., et al. REAVER: A program for improved analysis of high-resolution vascular network images. Microcirculation. 27 (5), e12618 (2020).
- Urban, G., et al. Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images. IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).
