Kanser Araştırmaları için Fizyolojik İnsan Vaskülarize Mikro-Tümör Modelinin Oluşturulması
Summary
Bu protokol, yükleme, bakım ve değerlendirme prosedürlerinin bir açıklamasıyla birlikte yüksek verimli temel ve translasyonel insan kanseri araştırmaları, gelişmiş ilaç taraması, hastalık modellemesi ve kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımları gerçekleştirmek için fizyolojik olarak ilgili bir çip üzerinde tümör modeli sunar.
Abstract
Solid kanserlerin tümör mikroçevresini in vitro olarak özetleyen doğrulanmış kanser modellerinin eksikliği, klinik öncesi kanser araştırmaları ve terapötik geliştirme için önemli bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, karmaşık insan tümör mikroçevresini gerçekçi bir şekilde modelleyen mikrofizyolojik bir sistem olan vaskülarize mikrotümörü (VMT) veya tümör çipini geliştirdik. VMT, dinamik, fizyolojik akış koşulları altında birden fazla insan hücresi tipinin birlikte kültürlenmesiyle mikroakışkan bir platform içinde de novo oluşturur. Bu doku mühendisliği mikro-tümör yapısı, tıpkı yeni oluşan damarların in vivo olarak yaptığı gibi, büyüyen tümör kitlesini destekleyen canlı bir perfüze vasküler ağ içerir. Daha da önemlisi, ilaçlar ve bağışıklık hücreleri, tümöre ulaşmak için endotel tabakasını geçmeli, terapötik uygulama ve etkinlik için in vivo fizyolojik engelleri modellemelidir. VMT platformu optik olarak şeffaf olduğundan, doku içindeki floresan etiketli hücrelerin doğrudan görüntülenmesi ile immün hücre ekstravazasyonu ve metastaz gibi dinamik süreçlerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi sağlanabilir. Ayrıca, VMT in vivo tümör heterojenliğini, gen ekspresyon imzalarını ve ilaç yanıtlarını korur. Hemen hemen her tümör tipi platforma uyarlanabilir ve taze cerrahi dokulardan elde edilen birincil hücreler büyür ve VMT’de ilaç tedavisine yanıt vererek gerçekten kişiselleştirilmiş tıbbın yolunu açar. Burada, VMT’yi kurma ve onkoloji araştırmaları için kullanma yöntemleri özetlenmiştir. Bu yenilikçi yaklaşım, tümörleri ve ilaç yanıtlarını incelemek için yeni olanaklar sunarak araştırmacılara kanser araştırmalarını ilerletmek için güçlü bir araç sağlar.
Introduction
Kanser dünya çapında önemli bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir ve Amerika Birleşik Devletleri’nde ikinci önde gelen ölüm nedenidir. Ulusal Sağlık İstatistikleri Merkezi, yalnızca 2023 yılı için ABD’de 1,9 milyondan fazla yeni kanser vakası ve 600.000’den fazla kanser ölümünün meydana gelmesini öngörüyor1 ve etkili tedavi yaklaşımlarına olan acil ihtiyacı vurguluyor. Bununla birlikte, şu anda, klinik araştırmalara giren anti-kanser terapötiklerinin yalnızca% 5.1’i nihayetinde FDA onayı almaktadır. Gelecek vaat eden adayların klinik çalışmalarda başarılı bir şekilde ilerleyememesi, kısmen klinik öncesi ilaç geliştirme sırasında 2D ve sferoid kültürler gibi fizyolojik olmayan model sistemlerinin kullanılmasına bağlanabilir2. Bu klasik kanser modelleri, terapötik direnç ve hastalık ilerlemesinin temel belirleyicileri olan stromal niş, ilişkili bağışıklık hücreleri ve perfüze damar sistemi gibi tümör mikroçevresinin temel bileşenlerinden yoksundur. Bu nedenle, klinik öncesi bulguların klinik translasyonunu iyileştirmek için insan in vivo tümör mikroçevresini daha iyi taklit eden yeni bir model sistem gereklidir.
Doku mühendisliği alanı hızla ilerlemekte ve laboratuvar ortamlarında insan hastalıklarını incelemek için gelişmiş yöntemler sunmaktadır. Önemli bir gelişme, sağlıklı veya hastalıklı koşulları kopyalayabilen işlevsel, minyatür insan organları olan organ çipleri veya doku çipleri olarak da bilinen mikrofizyolojik sistemlerin (MPS) ortaya çıkmasıdır 3,4,5. Bu kapsamda, onkoloji araştırmaları için üç boyutlu mikroakışkan tabanlı in vitro insan tümör modelleri olan tümör çipleri geliştirilmiştir 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Bu gelişmiş modeller, dinamik bir tümör mikro ortamı içinde biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarını bir araya getirerek, araştırmacıların tümör davranışını ve tedavilere verilen yanıtları fizyolojik olarak daha ilgili bir bağlamda incelemelerine olanak tanır. Bununla birlikte, bu gelişmelere rağmen, çok az sayıda grup, özellikle fizyolojik akışa yanıt olarak kendi kendine patern oluşturan canlı, fonksiyonel bir damar sistemini başarılı bir şekilde dahil etmiştir 3,4,5,6. İşlevsel bir vasküler ağın dahil edilmesi, ilaç veya hücre dağıtımını etkileyen fiziksel engellerin modellenmesine, farklı mikro ortamlara hücre hedeflemesine ve tümör, stromal ve immün hücrelerin transendotelyal göçüne izin verdiği için çok önemlidir. Bu özelliği dahil ederek, tümör çipi, in vivo tümör mikroçevresinde gözlemlenen karmaşıklıkları daha iyi temsil edebilir.
Bu karşılanmamış ihtiyacı karşılamak için, mikro damar ağlarının bir mikroakışkan cihaz içinde oluşmasını sağlayan yeni bir ilaç tarama platformu geliştirdik 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Vaskülarize mikro organ (VMO) olarak adlandırılan bu temel organ çipi platformu, hastalık modellemesi, ilaç taraması ve kişiselleştirilmiş tıp uygulamaları için orijinal doku fizyolojisini çoğaltmak için hemen hemen her organ sistemine uyarlanabilir. VMO’lar, endotelyal koloni oluşturan hücre kaynaklı endotel hücreleri (ECFC-EC), HUVEC veya iPSC-EC (bundan sonra EC olarak anılacaktır) ve matrisi yeniden şekillendiren normal insan akciğer fibroblastları (NHLF) ve damarları saran ve stabilize eden perisitler dahil olmak üzere odadaki çoklu stromal hücrelerin birlikte kültürlenmesiyle oluşturulur. VMO, vaskülarize bir mikro tümör (VMT)8,9,10,11,12,13 veya tümör çipi modeli oluşturmak için tümör hücrelerini ilişkili stroma ile birlikte kültürleyerek bir kanser modeli sistemi olarak da kurulabilir. Dinamik bir akış ortamında çoklu hücre tiplerinin birlikte kültürü yoluyla, perfüze mikrovasküler ağlar, vaskülogenezin interstisyel akış hızları14,15 tarafından yakından düzenlendiği cihazın doku odalarında de novo oluşturur. Ortam, kılcal damarlar için görülene benzer şekilde, 1.2 x 10-7 cm/s’lik bir geçirgenlik katsayısına sahip, doku odasının çevresindeki hücrelere yalnızca mikro damarlar aracılığıyla besin sağlayan bir hidrostatik basınç başlığı tarafından cihazın mikroakışkan kanallarından geçirilir in vivo8.
Kendi kendini organize eden mikro damarların VMT modeline dahil edilmesi önemli bir atılımı temsil eder, çünkü: 1) vaskülarize tümör kitlelerinin yapısını ve işlevini in vivo olarak taklit eder; 2) tümör-endotelyal ve stromal hücre etkileşimleri dahil olmak üzere metastazın temel basamaklarını modelleyebilir; 3) Besin ve ilaç dağıtımı için fizyolojik olarak seçici engeller oluşturur, farmasötik taramayı iyileştirir; ve 4) anti-anjiyojenik ve anti-metastatik yeteneklere sahip ilaçların doğrudan değerlendirilmesine izin verir. VMO/VMT platformu, karmaşık bir 3D mikro ortamda besinlerin, ilaçların ve bağışıklık hücrelerinin in vivo dağıtımını çoğaltarak, ilaç taraması yapmak ve kanser, vasküler veya organa özgü biyolojiyi incelemek için kullanılabilecek fizyolojik olarak ilgili bir modeldir. Daha da önemlisi, VMT, kolon kanseri, melanom, meme kanseri, glioblastom, akciğer kanseri, periton karsinomatozu, yumurtalık kanseri ve pankreas kanseri dahil olmak üzere çeşitli tümör türlerinin büyümesini destekler 8,9,10,11,12,13. Düşük maliyetli, kolay kurulabilen ve yüksek verimli deneyler için dizilebilen mikroakışkan platform, tümör-stromal etkileşimlerin gerçek zamanlı görüntü analizi ve uyaranlara veya terapötiklere yanıt için tamamen optik olarak uyumludur. Sistemdeki her hücre tipi, tüm deney boyunca hücre davranışının doğrudan görselleştirilmesine ve izlenmesine izin vermek için farklı bir floresan işaretleyici ile etiketlenir ve dinamik tümör mikro ortamına bir pencere oluşturur. VMT’nin in vivo tümör büyümesini, mimarisini, heterojenliğini, gen ekspresyon imzalarını ve ilaç yanıtlarını standart kültür modalitelerinden daha sadık bir şekilde modellediğini daha önce göstermiştik10. Daha da önemlisi, VMT, ana tümörlerin patolojisini standart sferoid kültürlerden daha iyi modelleyen ve kişiselleştirilmiş tıp çabalarını daha da ilerleten kanser hücreleri de dahil olmak üzere hasta kaynaklı hücrelerin büyümesini ve çalışmasını destekler11. Bu el yazması, VMT’yi kurma yöntemlerini özetlemekte ve insan kanserlerini incelemek için faydasını göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vücuttaki hemen hemen her doku, damar sistemi yoluyla besin ve oksijen alır, bu da onu gerçekçi hastalık modellemesi ve in vitro ilaç taraması için kritik bir bileşen haline getirir. Ayrıca, çeşitli maligniteler ve hastalık durumları vasküler endotel disfonksiyonu ve hiperpermeabilite ile tanımlanır3. Özellikle, kanserde, tümörle ilişkili damar sistemi genellikle kötü perfüze edilir, bozulur ve sızdırır, bu nedenle tümöre terapötik ve bağışıklık hücresi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Christopher Hughes’un laboratuvarının üyelerine, açıklanan prosedürlere değerli katkıları için ve Dr. Abraham Lee’nin laboratuvarındaki işbirlikçilerimize platform tasarımı ve üretimi konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) ve TL1 TR001415 ve W81XWH2110393 (SJH).
Materials
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
- Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. Applications of tumor chip technology. Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).
- Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W. The vascular niche in next generation microphysiological systems. Lab Chip. 21 (17), 3615-3616 (2021).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Vascularized microfluidic organ-chips for drug screening, disease models and tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 52, 116-123 (2018).
- Shirure, V. S., Hughes, C. C. W., George, S. C. Engineering vascularized organoid-on-a-chip models. Annu Rev Biomed Eng. 23, 141-167 (2021).
- Del Piccolo, N., et al. Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis. Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798 (2021).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nat Rev Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Sci Rep. 6, 31589 (2016).
- Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
- Hachey, S. J., et al. An in vitro vascularized micro-tumor model of human colorectal cancer recapitulates in vivo responses to standard-of-care therapy. Lab Chip. 21 (7), 1333-1351 (2021).
- Hachey, S. J., et al. A Human Vascularized Micro-Tumor Model of Patient-Derived Colorectal Cancer Recapitulates Clinical Disease. Transl Res. 255, 97-108 (2023).
- Liu, Y., et al. Human in vitro vascularized micro-organ and micro-tumor models are reproducible organ-on-a-chip platforms for studies of anticancer drugs. Toxicology. 445, 152601 (2020).
- Jahid, S., et al. Structure-based Design of CDC42 Effector Interaction Inhibitors for the Treatment of Cancer. Cell Rep. 39 (4), 110760 (2022).
- Hsu, Y. H., Moya, M. L., Hughes, C. C. W., George, S. C., Lee, A. P. A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological vascularized tissue arrays. Lab Chip. 13 (15), 2990-2998 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Christopher, C. W. H., George, S. C. In vitro perfused human capillary networks. Tissue Eng – Part C: Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Wang, X., et al. An on-chip microfluidic pressure regulator that facilitates reproducible loading of cells and hydrogels into microphysiological system platforms. Lab Chip. 16 (5), 868-876 (2016).
- Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Exp Biol Med. 242 (17), 1669-1678 (2017).
- Kurokawa, Y. K., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells for three-dimensional microphysiological systems. Tissue Eng Part C: Methods. 23 (8), 474-484 (2017).
- Romero-López, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS one. 6 (11), e27385 (2011).
- Corliss, B. A., et al. REAVER: A program for improved analysis of high-resolution vascular network images. Microcirculation. 27 (5), e12618 (2020).
- Urban, G., et al. Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images. IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).
