JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
의학

اضطراب الحاجز الدموي الدماغي للفأر بواسطة حويصلات صغيرة خارج الخلية من المشيمة البشرية التي تعاني من نقص الأكسجين

Published: January 26, 2024
doi:
10.3791/65867
, , , , , , , , ,
1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences,Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty,Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department,Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine,Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences,Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

Summary

يتم تقديم بروتوكول لتقييم ما إذا كانت EVs الصغيرة (sEVs) المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظل ظروف نقص الأكسجين (نمذجة جانب واحد من تسمم الحمل) تعطل الحاجز الدموي الدماغي في إناث الفئران البالغة غير الحوامل.

Abstract

وتشكل المضاعفات الدماغية الوعائية، بما في ذلك الوذمة الدماغية والسكتة الدماغية الإقفارية والنزفية، السبب الرئيسي لوفيات الأمهات المرتبطة بمقدمات الارتعاج. الآليات الكامنة وراء هذه المضاعفات الدماغية الوعائية لا تزال غير واضحة. ومع ذلك ، فهي مرتبطة بخلل المشيمة واضطراب حاجز الدم في الدماغ (BBB). ومع ذلك ، لا يزال يتم تحديد العلاقة بين هذين الجهازين البعيدين. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن المشيمة تطلق جزيئات الإشارة ، بما في ذلك الحويصلات خارج الخلية ، في الدورة الدموية للأم. يتم تصنيف الحويصلات خارج الخلية وفقا لحجمها ، مع الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs أصغر من 200 نانومتر في القطر) تعتبر جزيئات إشارات حرجة في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. في تسمم الحمل ، هناك عدد متزايد من sEVs المتداولة في الدورة الدموية للأمهات ، والتي لا يتم فهم وظيفة الإشارة إليها جيدا. تحفز التشوهات المشيمية التي يتم إطلاقها في مقدمات الارتعاج أو من مشيمة الحمل الطبيعية المعرضة لنقص الأكسجة الخلل البطاني في الدماغ وتعطيل BBB. في هذا البروتوكول ، نقوم بتقييم ما إذا كانت sEVs المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظل ظروف نقص الأكسجين (نمذجة جانب واحد من تسمم الحمل) تعطل BBB في الجسم الحي.

Introduction

ما يقرب من 70 ٪ من وفيات الأمهات بسبب تسمم الحمل ، ومتلازمة الحمل ارتفاع ضغط الدم التي تتميز بضعف عمليات المشيمة ، والخلل البطاني الجهازي للأم ، وفي الحالات الشديدة ، الفشل متعدد الأعضاء1،2 ، ترتبط بمضاعفات الأوعية الدموية الدماغية الحادة 3,4. تحدث معظم وفيات الأمهات في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل5. ومع ذلك ، لا تزال الآليات الأساسية غير واضحة على الرغم من الأهمية السريرية والوبائية للمضاعفات الدماغية الوعائية المرتبطة بتسمم الحمل.

من ناحية أخرى ، تعد الحويصلات خارج الخلية (EVs) (القطر ~ 30-400 نانومتر) وسطاء أساسيين للتواصل بين الخلايا بين الأنسجة والأعضاء ، بما في ذلك التفاعل بين الأم والمشيمة6. بالإضافة إلى البروتينات والدهون على السطح الخارجي ، تحمل المركبات الكهربائية البضائع داخل (البروتينات والحمض النووي الريبي والدهون). يمكن تصنيف EVs إلى (1) exosomes (قطر ~ 50-150 نانومتر ، وتسمى أيضا EVs الصغيرة (sEVs)) ، (2) EVs متوسطة / كبيرة ، و (3) أجسام موت الخلايا المبرمج ، والتي تختلف حسب الحجم ، والتكوين الحيوي ، والمحتوى ، ووظيفة الإشارات المحتملة. يتم تحديد تكوين EVs من خلال الخلايا التي تنشأ منها ونوع المرض7. تعبر المركبات الكهربائية المشتقة من الأرومة المخلبية عن الفوسفاتيز القلوي المشيمي (PLAP)8,9 ، والذي يكتشف المركبات الكهربائية الصغيرة المنتشرة المشتقة من المشيمة (PDsEVs) أثناء الحمل. أيضا ، يساعد PLAP على تمييز التغيرات في حمولة PDsEVs وآثارها في تسمم الحمل مقابل الحمل المعياري10،11،12،13،14،15.

تم التعرف على المشيمة كعنصر ضروري في الفيزيولوجيا المرضية لتسمم الحمل16 أو المضاعفات الدماغية المرتبطة بهذا المرض17،18،19. ومع ذلك ، كيف يمكن لهذا العضو البعيد أن يحدث تغييرات في الدورة الدموية في الدماغ غير معروف. نظرا لأن sEVs تلعب أدوارا محورية في الاتصال من خلية إلى خلية نظرا لقدرتها على نقل المكونات النشطة بيولوجيا من الخلايا المانحة إلى الخلايا المتلقية6،20،21 ، فقد ربط عدد متزايد من الدراسات sEVs المشيمة بتوليد خلل وظيفي في بطانة الأم21،22،23،24 ، بما في ذلك الخلايا البطانية للدماغ25,26في النساء المصابات بتسمم الحمل. وبالتالي ، فإن حل وسط وظيفة بطانة الدماغ قد يؤدي إلى تعطيل الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ، وهو عنصر حاسم في المضاعفات الوعائية الدماغية المرتبطة بتسمم الحمل3،27.

ومع ذلك ، فإن النتائج قبل السريرية باستخدام الأوعية الدماغية للفئران المعرضة لمصل النساء المصابات بتسمم الحمل28 أو الخلايا البطانية للدماغ البشري المعرضة لبلازما النساء المصابات بتسمم الحمل29 ذكرت أن العامل (العوامل) المنتشرة تحفز تعطيل BBB. على الرغم من وجود العديد من المرشحين الذين لديهم القدرة على إلحاق الضرر ب BBB الموجود في الدورة الدموية للأم أثناء تسمم الحمل ، مثل المستويات المرتفعة من السيتوكينات المسببة للالتهابات (أي عامل نخر الورم)18,28 أو منظمات الأوعية الدموية (أي عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF))29,30,31 ، أو الجزيئات المؤكسدة مثل البروتينات الدهنية المؤكسدة (oxo-LDL)32,33 ، من بين أمور أخرى34، لا يقيم أي منهم اتصالا مباشرا بين المشيمة و BBB. في الآونة الأخيرة ، أظهرت sEVs المعزولة من المشيمة التي تعاني من نقص الأكسجين القدرة على تعطيل BBB في الفئران الإناث غيرالحوامل 25. نظرا لأن sEVs المشيمة قد تحمل معظم العوامل المتداولة المدرجة مع القدرة على تعطيل BBB ، تعتبر sEVs مرشحة مناسبة لتوصيل المشيمة المصابة ، وتكون حاملة لعوامل الدورة الدموية الضارة ، وتعطل BBB في تسمم الحمل.

يسمح لنا هذا البروتوكول بالتحقيق فيما إذا كانت sEVs المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظل ظروف نقص الأكسجين يمكن أن تعطل BBB في إناث الفئران غير الحوامل كوكيل لفهم الفيزيولوجيا المرضية للمضاعفات الدماغية أثناء تسمم الحمل.

Protocol

تم إجراء البحث وفقا للمبادئ المعبر عنها في إعلان هلسنكي وبإذن من مجالس المراجعة الأخلاقية المعنية. أعطى جميع المشاركين من البشر موافقتهم المستنيرة قبل جمع العينات ، كما ورد سابقا25. وبالإضافة إلى ذلك، وافقت لجنة أخلاقيات البيولوجيا والسلامة البيولوجية التابعة لجامعة بيو – بي…

Representative Results

يقيم هذا البروتوكول قدرة sEVs المشتقة من المشيمة المزروعة في نقص الأكسجة على تعطيل BBB في الفئران غير الحوامل. تسمح هذه الطريقة للمرء بفهم أفضل للعلاقة المحتملة بين المشيمة والدماغ في الظروف الطبيعية والمرضية. على وجه الخصوص ، قد تشكل هذه الطريقة وكيلا لتحليل مشاركة sEVs المشيمة في بداية المضا…

Discussion

تكشف هذه الدراسة النقاب عن رؤى جديدة حول الضرر المحتمل الناتج عن sEVs المعزولة من نباتات المشيمة المزروعة في ظروف نقص الأكسجين على اضطراب حاجز الدم في دماغ القوارض. تتضمن الآلية المرضية انخفاضا في CLND-5 في منطقة الدماغ الخلفية25.

كشفت التحقيقات السابقة أن البلازما …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يود المؤلفون أن يشكروا الباحثين الذين ينتمون إلى GRIVAS Health على مدخلاتهم القيمة. كما تنتمي القابلات والموظفون السريريون من خدمة أمراض النساء والتوليد إلى مستشفى دي شيلان ، تشيلي. أسسها فونديسيت العادية 1200250.

Materials

Adult mice brain slecer matrice 3D printed Open access file Adult mice Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament.
Anti β-Actin primary antibody Sigma-Aldrich Clon AC-74 Antibody for loading control (Western blot)
Anti-Claudin5 primary antibody Santa cruz Biotechnology sc-374221 Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot)
BCA protein kit Thermo Scientific 23225 Kit for measuring protein concentration
Culture media #200 500 mL Thermo Fisher Scientific m200500 Culture media for placental explants
D180 CO2 incubator RWD Life science D180 Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor
Evans blue dye  > 75% 10 g Sigma-Aldrich E2129.10G Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO
Fetal bovine serum 500 mL Thermo Fisher Scientific 16000044 Additive growth factor for culture media 200
Himac Ultracentrifuge CP100NX Himac eppendorf group 5720410101 Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g
ImageJ software NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 mL USP Baxter 212-094 Volatile inhalated anaesthesia agent for mice
Kit CellTiter 96 Non-radioactive  Promega 0000105232 In vitro assay for placental explants viability
Mouse IgG Secondary antibody Thermo Fisher Scientific MO 63103 Secondary antibody for CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300 Malvern Panalytical 90278090 Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL Thermo Fisher Scientific A11313.22 Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted)
PBS 1 X pH 7.4 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010023 Wash solution for placenta explants
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL Thermo Fisher Scientific 10378016 Antiobiotics for placental explants culture media
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller BioSpherix SCR_021131 CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 g Chemie 7061 humanitarian euthanasia agent
Somnosuite low flow anesthesia system Kent Scientifics SS-01 Isoflurane vaporizer for small rodents
Surgical Warming platform Kent Scientifics A41166 Warming platform for mainteinance anesthesia in mice
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm Southern labware 10026 Filtration of condicioned media harvested from placental explants 
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE Hitachi medical systems 6020 Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x  Center Medical 2597 Stereomicroscope to register brain slices
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
  2. Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M. Preeclampsia. Lancet. 365 (9461), 785-799 (2005).
  3. Hammer, E. S., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction in preeclamptic pregnancies. Curr Hypertens Rep. 17 (8), 64 (2015).
  4. Okanloma, K. A., Moodley, J. Neurological complications associated with the preeclampsia/eclampsia syndrome. Int J Gynaecol Obstet. 71, 223-225 (2000).
  5. Frias, A. E., Belfort, M. A. Post magpie: how should we be managing severe preeclampsia. Curr Opin Gynecol Obstet. 15 (6), 489-495 (2003).
  6. Familari, M., Cronqvist, T., Masoumi, Z., Hansson, S. R. Placenta-derived extracellular vesicles: Their cargo and possible functions. Reprod Fertil Dev. 29 (3), 433-447 (2017).
  7. Montoro-Garcia, S., Shantsila, E., Marin, F., Blann, A., Lip, G. Y. Circulating microparticles: new insights into the biochemical basis of microparticle release and activity. Basic Res Cardiol. 106, 911-923 (2011).
  8. Germain, S. J., Sacks, G. P., Sooranna, S. R., Sargent, I. L., Redman, C. W. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and preeclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles. J Immunol. 178 (9), 5949-5956 (2007).
  9. Tannetta, D., Masliukaite, I., Vatish, M., Redman, C., Sargent, I. Update of syncytiotrophoblast derived extracellular vesicles in normal pregnancy and preeclampsia. J Reprod Immunol. 119, 98-106 (2017).
  10. Collett, G. P., Redman, C. W., Sargent, I. L., Vatish, M. Endoplasmic reticulum stress stimulates the release of extracellular vesicles carrying danger-associated molecular pattern (DAMP) molecules. Oncotarget. 9 (6), 6707-6717 (2018).
  11. Cooke, W. R., et al. Maternal circulating syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles contain biologically active 5′-tRNA halves. Biochem Biophys Res Commun. 518 (1), 107-113 (2019).
  12. Gill, M., et al. Placental syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles carry active nep (neprilysin) and are increased in preeclampsia. Hypertension. 73 (5), 1112-1119 (2019).
  13. Kandzija, N., et al. Placental extracellular vesicles express active dipeptidyl peptidase IV; levels are increased in gestational diabetes mellitus. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1617000 (2019).
  14. Motta-Mejia, C., et al. Placental vesicles carry active endothelial nitric oxide synthase and their activity is reduced in preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 372-381 (2017).
  15. Sammar, M., et al. Reduced placental protein 13 (PP13) in placental derived syncytiotrophoblast extracellular vesicles in preeclampsia – A novel tool to study the impaired cargo transmission of the placenta to the maternal organs. Placenta. 66, 17-25 (2018).
  16. Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
  17. Warrington, J. P., et al. Placental ischemia in pregnant rats impairs cerebral blood flow autoregulation and increases blood-brain barrier permeability. Physiological Reports. 2 (8), e12134-e12134 (2014).
  18. Warrington, J. P., Drummond, H. A., Granger, J. P., Ryan, M. J. Placental Ischemia-induced increases in brain water content and cerebrovascular permeability: Role of TNFα. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (11), R1425-R1431 (2015).
  19. Johnson, A. C., et al. Magnesium sulfate treatment reverses seizure susceptibility and decreases neuroinflammation in a rat model of severe preeclampsia. PLoS ONE. 9 (11), e113670 (2014).
  20. Escudero, C. A., et al. Role of extracellular vesicles and microRNAs on dysfunctional angiogenesis during preeclamptic pregnancies. Front Physiol. 7, 1-17 (2016).
  21. Salomon, C., et al. Placental exosomes as early biomarker of preeclampsia: Potential role of exosomalmicrornas across gestation. J Clin Endocrinol Metab. 102 (9), 3182-3194 (2017).
  22. Knight, M., Redman, C. W., Linton, E. A., Sargent, I. L. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. Br J Obstet Gynaecol. 105 (6), 632-640 (1998).
  23. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and extracellular vesicles. Curr Hypertens Rep. 18 (9), 68 (2016).
  24. Dutta, S., et al. Hypoxia-induced small extracellular vesicle proteins regulate proinflammatory cytokines and systemic blood pressure in pregnant rats. Clin Sci (Lond). 134 (6), 593-607 (2020).
  25. Leon, J., et al. Disruption of the blood-brain barrier by extracellular vesicles from preeclampsia plasma and hypoxic placentae: attenuation by magnesium sulfate. Hypertension. 78 (5), 1423-1433 (2021).
  26. Han, C., et al. Placenta-derived extracellular vesicles induce preeclampsia in mouse models. Haematologica. 105 (6), 1686-1694 (2020).
  27. Amburgey, O. A., Chapman, A. C., May, V., Bernstein, I. M., Cipolla, M. J. Plasma from preeclamptic women increases blood-brain barrier permeability: role of vascular endothelial growth factor signaling. Hypertension. 56 (5), 1003-1008 (2010).
  28. Cipolla, M. J., et al. Pregnant serum induces neuroinflammation and seizure activity via TNFalpha. Exp Neurol. 234 (2), 398-404 (2012).
  29. Bergman, L., et al. Preeclampsia and increased permeability over the blood brain barrier – a role of vascular endothelial growth receptor 2. Am J Hypertens. 34 (1), 73-81 (2021).
  30. Torres-Vergara, P., et al. Dysregulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 phosphorylation is associated with disruption of the blood-brain barrier and brain endothelial cell apoptosis induced by plasma from women with preeclampsia. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (9), 166451 (2022).
  31. Schreurs, M. P., Houston, E. M., May, V., Cipolla, M. J. The adaptation of the blood-brain barrier to vascular endothelial growth factor and placental growth factor during pregnancy. FASEB J. 26 (1), 355-362 (2012).
  32. Schreurs, M. P., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction and blood-brain barrier permeability induced by oxidized LDL are prevented by apocynin and magnesium sulfate in female rats. J Cardiovasc Pharmacol. 63 (1), 33-39 (2014).
  33. Schreurs, M. P. H., et al. Increased oxidized low-density lipoprotein causes blood-brain barrier disruption in early-onset preeclampsia through LOX-1. FASEB J. 27 (3), 1254-1263 (2013).
  34. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. 80 (2), 242-256 (2023).
  35. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. Universities Federation of Animal Welfare. , (1959).
  36. Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
  37. Troncoso, F. A. J., Herlitz, K., Ruiz, F., Bertoglia, P., Escudero, C. Elevated pro-angiogenic phenotype in feto-placental tissue from gestational diabetes mellitus. Placenta. 36 (4), 2 (2015).
  38. Zhang, H. C., et al. Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (18), 3289-3297 (2012).
  39. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3), 22 (2006).
  40. Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), e13124 (2010).
  41. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988 (2021).
  42. Walchli, T., et al. Quantitative assessment of angiogenesis, perfused blood vessels and endothelial tip cells in the postnatal mouse brain. Nat Protoc. 10 (1), 53-74 (2015).
  43. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588 (2014).
  44. Morita, K., Sasaki, H., Furuse, M., Tsukita, S. Endothelial claudin: claudin-5/TMVCF constitutes tight junction strands in endothelial cells. J Cell Biol. 147 (1), 185-194 (1999).
  45. Lara, E., et al. Abnormal cerebral microvascular perfusion and reactivity in female offspring of reduced uterine perfusion pressure (RUPP) mice model. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (12), 2318-2332 (2022).
  46. Chang, X., et al. Exosomes from women with preeclampsia induced vascular dysfunction by delivering sflt (soluble fms-like tyrosine kinase)-1 and seng (soluble endoglin) to endothelial cells. Hypertension. 72, 1381-1390 (2018).
  47. Smarason, A. K., Sargent, I. L., Starkey, P. M., Redman, C. W. The effect of placental syncytiotrophoblast microvillous membranes from normal and pre-eclamptic women on the growth of endothelial cells in vitro. BJOG. 100 (10), 943-949 (1993).

Tags

Extracellular VesiclesBlood-brain BarrierPlacentaPreeclampsiaHypoxiaCerebrovascular ComplicationsMaternal MortalityBrain Endothelial Dysfunction
check_url/kr/65867?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sandoval, H., León, J., Troncoso, F., de la Hoz, V., Cisterna, A., Contreras, M., Castro, F. O., Ibañez, B., Acurio, J., Escudero, C. Disruption of the Mouse Blood-Brain Barrier by Small Extracellular Vesicles from Hypoxic Human Placentas. J. Vis. Exp. (203), e65867, doi:10.3791/65867 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image