JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
의학

Verstoring van de bloed-hersenbarrière van muizen door kleine extracellulaire blaasjes van hypoxische menselijke placenta's

Published: January 26, 2024
doi:
10.3791/65867
, , , , , , , , ,
1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences,Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty,Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department,Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine,Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences,Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

Summary

Er wordt een protocol gepresenteerd om te evalueren of kleine EV’s (sEV’s) geïsoleerd uit placenta-explantaten gekweekt onder hypoxische omstandigheden (modellering van één aspect van pre-eclampsie) de bloed-hersenbarrière verstoren bij niet-zwangere volwassen vrouwelijke muizen.

Abstract

Cerebrovasculaire complicaties, waaronder hersenoedeem en ischemische en hemorragische beroerte, vormen de belangrijkste oorzaak van moedersterfte geassocieerd met pre-eclampsie. De onderliggende mechanismen van deze cerebrovasculaire complicaties blijven onduidelijk. Ze zijn echter gekoppeld aan placentadisfunctie en verstoring van de bloed-hersenbarrière (BBB). Niettemin wordt het verband tussen deze twee verre organen nog steeds vastgesteld. Toenemend bewijs suggereert dat de placenta signaalmoleculen, waaronder extracellulaire blaasjes, afgeeft aan de maternale circulatie. Extracellulaire blaasjes worden gecategoriseerd op basis van hun grootte, waarbij kleine extracellulaire blaasjes (sEV’s kleiner dan 200 nm in diameter) worden beschouwd als kritische signaaldeeltjes in zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. Bij pre-eclampsie is er een verhoogd aantal circulerende sEV’s in de maternale circulatie, waarvan de signaalfunctie niet goed wordt begrepen. Placenta-sEV’s die vrijkomen bij pre-eclampsie of van normale zwangerschapsplacenta’s die worden blootgesteld aan hypoxie, veroorzaken endotheeldisfunctie in de hersenen en verstoring van de BBB. In dit protocol beoordelen we of sEV’s geïsoleerd uit placenta-explantaten gekweekt onder hypoxische omstandigheden (modellering van een aspect van pre-eclampsie) de BBB in vivo verstoren.

Introduction

Ongeveer 70% van de maternale sterfte als gevolg van pre-eclampsie, een hypertensief zwangerschapssyndroom dat wordt gekenmerkt door verminderde placentatieprocessen, maternale systemische endotheeldisfunctie en, in ernstige gevallen, multi-orgaanfalen 1,2, wordt geassocieerd met acute cerebrovasculaire complicaties 3,4. De meeste moedersterfte komt voor in lage- en middeninkomenslanden5. De onderliggende mechanismen zijn echter nog steeds onduidelijk, ondanks de klinische en epidemiologische relevantie van cerebrovasculaire complicaties geassocieerd met pre-eclampsie.

Aan de andere kant zijn extracellulaire vesikels (EV’s) (diameter ~30-400 nm) essentiële mediatoren van intercellulaire communicatie tussen weefsels en organen,inclusief maternale en placenta-interactie6. Naast eiwitten en lipiden op het uitwendige oppervlak, vervoeren EV’s lading naar binnen (eiwitten, RNA en lipiden). EV’s kunnen worden onderverdeeld in (1) exosomen (diameter ~50-150 nm, ook wel kleine EV’s (sEV’s) genoemd), (2) middelgrote/grote EV’s en (3) apoptotische lichamen, die verschillen in grootte, biogenese, inhoud en potentiële signaalfunctie. De samenstelling van EV’s wordt bepaald door de cellen waaruit ze afkomstig zijn en het ziektetype7. Syncytiotrofoblast-afgeleide EV’s brengen placenta alkalische fosfatase (PLAP)8,9 tot expressie, die van placentae afgeleide circulerende kleine EV’s (PDsEV’s) tijdens de zwangerschap detecteert. PLAP helpt ook bij het onderscheiden van veranderingen in de lading van de PD’sEV’s en hun effecten bij pre-eclampsie versus normotensieve zwangerschappen 10,11,12,13,14,15.

De placenta is erkend als de noodzakelijke component in de pathofysiologie van pre-eclampsie16 of cerebrale complicaties geassocieerd met deze ziekte 17,18,19. Het is echter onbekend hoe dit verre orgaan veranderingen in de hersencirculatie kan veroorzaken. Aangezien sEV’s een cruciale rol spelen in cel-tot-celcommunicatie vanwege hun vermogen om bioactieve componenten over te dragen van donor- naar ontvangercellen 6,20,21, heeft een groeiend aantal onderzoeken placenta-sEV’s in verband gebracht met het ontstaan van maternale endotheeldisfunctie 21,22,23,24, inclusief endotheelcellen in de hersenen 25,26bij vrouwen met pre-eclampsie. Het compromitteren van de endotheelfunctie van de hersenen kan dus leiden tot verstoring van de bloed-hersenbarrière (BBB), een cruciaal onderdeel bij cerebrovasculaire complicaties geassocieerd met pre-eclampsie3,27.

Niettemin meldden preklinische bevindingen met behulp van cerebrale vaten van ratten die waren blootgesteld aan serum van vrouwen met pre-eclampsie28 of menselijke endotheelcellen van de hersenen die waren blootgesteld aan plasma van vrouwen met pre-eclampsie29 dat circulerende factor(en) verstoring van de BBB veroorzaken. Ondanks verschillende kandidaten met het potentieel om de BBB te schaden die aanwezig is in de maternale circulatie tijdens pre-eclampsie, zoals verhoogde niveaus van pro-inflammatoire cytokines (d.w.z. tumornecrosefactor)18,28 of vasculaire regulatoren (d.w.z. vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF))29,30,31, of oxidatieve moleculen zoals geoxideerde lipoproteïnen (oxo-LDL)32,33, onder andere 34, geen van hen brengt een directe verbinding tot stand tussen de placenta en de BBB. Onlangs hebben sEV’s geïsoleerd uit hypoxische placenta’s aangetoond dat ze de BBB kunnen verstoren bij niet-zwangere vrouwelijke muizen25. Aangezien placenta-sEV’s de meeste van de genoemde circulerende factoren kunnen dragen met het vermogen om de BBB te verstoren, worden sEV’s beschouwd als geschikte kandidaten om de gewonde placenta te verbinden, de drager te zijn van schadelijke circulerende factoren en de BBB te verstoren bij pre-eclampsie.

Dit protocol stelt ons in staat om te onderzoeken of sEV’s geïsoleerd uit placenta-explantaten gekweekt onder hypoxische omstandigheden de BBB kunnen verstoren bij niet-zwangere vrouwelijke muizen als een proxy voor het begrijpen van de pathofysiologie van cerebrale complicaties tijdens pre-eclampsie.

Protocol

Het onderzoek werd uitgevoerd volgens de principes die zijn verwoord in de Verklaring van Helsinki en met toestemming van de respectieve ethische beoordelingscommissies. Alle menselijke deelnemers gaven hun geïnformeerde toestemming vóór het verzamelen van monsters, zoals eerder gerapporteerd25. Bovendien keurde de Commissie Bio-ethiek en Bioveiligheid van de Universiteit van Bío-Bío dit project goed (Fondecyt-subsidie 1200250). Het dierwerk werd uitgevoerd in overeenstemming met de kardinale…

Representative Results

Dit protocol evalueert het vermogen van sEV’s afkomstig van placenta’s die zijn gekweekt in hypoxie om de BBB bij niet-zwangere muizen te verstoren. Deze methode stelt het mogelijk om de mogelijke verbinding tussen de placenta en de hersenen in normale en pathologische omstandigheden beter te begrijpen. In het bijzonder kan deze methode een proxy zijn voor het analyseren van de deelname van placenta-sEV’s aan het ontstaan van cerebrale complicaties bij pre-eclampsie. In tegenstelling tot muize…

Discussion

Deze studie onthult nieuwe inzichten in mogelijke schade als gevolg van sEV’s geïsoleerd uit placenta-explantaten gekweekt in hypoxische omstandigheden op de verstoring van de bloed-hersenbarrière van knaagdieren. Het pathologische mechanisme omvat een vermindering van CLND-5 in het achterste hersengebied25.

Eerder onderzoek heeft aangetoond dat plasma-sEV’s van personen met pre-eclampsie endotheeldisfunctie induceren in verschillende organen met behulp van in vit…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen de onderzoekers van GRIVAS Health bedanken voor hun waardevolle input. Ook verloskundigen en klinisch personeel van de dienst Verloskunde en Gynaecologie behoren tot het Hospital de Chillan, Chili. Opgericht door Fondecyt Regular 1200250.

Materials

Adult mice brain slecer matrice 3D printed Open access file Adult mice Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament.
Anti β-Actin primary antibody Sigma-Aldrich Clon AC-74 Antibody for loading control (Western blot)
Anti-Claudin5 primary antibody Santa cruz Biotechnology sc-374221 Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot)
BCA protein kit Thermo Scientific 23225 Kit for measuring protein concentration
Culture media #200 500 mL Thermo Fisher Scientific m200500 Culture media for placental explants
D180 CO2 incubator RWD Life science D180 Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor
Evans blue dye  > 75% 10 g Sigma-Aldrich E2129.10G Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO
Fetal bovine serum 500 mL Thermo Fisher Scientific 16000044 Additive growth factor for culture media 200
Himac Ultracentrifuge CP100NX Himac eppendorf group 5720410101 Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g
ImageJ software NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 mL USP Baxter 212-094 Volatile inhalated anaesthesia agent for mice
Kit CellTiter 96 Non-radioactive  Promega 0000105232 In vitro assay for placental explants viability
Mouse IgG Secondary antibody Thermo Fisher Scientific MO 63103 Secondary antibody for CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300 Malvern Panalytical 90278090 Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL Thermo Fisher Scientific A11313.22 Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted)
PBS 1 X pH 7.4 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010023 Wash solution for placenta explants
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL Thermo Fisher Scientific 10378016 Antiobiotics for placental explants culture media
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller BioSpherix SCR_021131 CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 g Chemie 7061 humanitarian euthanasia agent
Somnosuite low flow anesthesia system Kent Scientifics SS-01 Isoflurane vaporizer for small rodents
Surgical Warming platform Kent Scientifics A41166 Warming platform for mainteinance anesthesia in mice
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm Southern labware 10026 Filtration of condicioned media harvested from placental explants 
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE Hitachi medical systems 6020 Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x  Center Medical 2597 Stereomicroscope to register brain slices
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
  2. Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M. Preeclampsia. Lancet. 365 (9461), 785-799 (2005).
  3. Hammer, E. S., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction in preeclamptic pregnancies. Curr Hypertens Rep. 17 (8), 64 (2015).
  4. Okanloma, K. A., Moodley, J. Neurological complications associated with the preeclampsia/eclampsia syndrome. Int J Gynaecol Obstet. 71, 223-225 (2000).
  5. Frias, A. E., Belfort, M. A. Post magpie: how should we be managing severe preeclampsia. Curr Opin Gynecol Obstet. 15 (6), 489-495 (2003).
  6. Familari, M., Cronqvist, T., Masoumi, Z., Hansson, S. R. Placenta-derived extracellular vesicles: Their cargo and possible functions. Reprod Fertil Dev. 29 (3), 433-447 (2017).
  7. Montoro-Garcia, S., Shantsila, E., Marin, F., Blann, A., Lip, G. Y. Circulating microparticles: new insights into the biochemical basis of microparticle release and activity. Basic Res Cardiol. 106, 911-923 (2011).
  8. Germain, S. J., Sacks, G. P., Sooranna, S. R., Sargent, I. L., Redman, C. W. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and preeclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles. J Immunol. 178 (9), 5949-5956 (2007).
  9. Tannetta, D., Masliukaite, I., Vatish, M., Redman, C., Sargent, I. Update of syncytiotrophoblast derived extracellular vesicles in normal pregnancy and preeclampsia. J Reprod Immunol. 119, 98-106 (2017).
  10. Collett, G. P., Redman, C. W., Sargent, I. L., Vatish, M. Endoplasmic reticulum stress stimulates the release of extracellular vesicles carrying danger-associated molecular pattern (DAMP) molecules. Oncotarget. 9 (6), 6707-6717 (2018).
  11. Cooke, W. R., et al. Maternal circulating syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles contain biologically active 5′-tRNA halves. Biochem Biophys Res Commun. 518 (1), 107-113 (2019).
  12. Gill, M., et al. Placental syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles carry active nep (neprilysin) and are increased in preeclampsia. Hypertension. 73 (5), 1112-1119 (2019).
  13. Kandzija, N., et al. Placental extracellular vesicles express active dipeptidyl peptidase IV; levels are increased in gestational diabetes mellitus. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1617000 (2019).
  14. Motta-Mejia, C., et al. Placental vesicles carry active endothelial nitric oxide synthase and their activity is reduced in preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 372-381 (2017).
  15. Sammar, M., et al. Reduced placental protein 13 (PP13) in placental derived syncytiotrophoblast extracellular vesicles in preeclampsia – A novel tool to study the impaired cargo transmission of the placenta to the maternal organs. Placenta. 66, 17-25 (2018).
  16. Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
  17. Warrington, J. P., et al. Placental ischemia in pregnant rats impairs cerebral blood flow autoregulation and increases blood-brain barrier permeability. Physiological Reports. 2 (8), e12134-e12134 (2014).
  18. Warrington, J. P., Drummond, H. A., Granger, J. P., Ryan, M. J. Placental Ischemia-induced increases in brain water content and cerebrovascular permeability: Role of TNFα. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (11), R1425-R1431 (2015).
  19. Johnson, A. C., et al. Magnesium sulfate treatment reverses seizure susceptibility and decreases neuroinflammation in a rat model of severe preeclampsia. PLoS ONE. 9 (11), e113670 (2014).
  20. Escudero, C. A., et al. Role of extracellular vesicles and microRNAs on dysfunctional angiogenesis during preeclamptic pregnancies. Front Physiol. 7, 1-17 (2016).
  21. Salomon, C., et al. Placental exosomes as early biomarker of preeclampsia: Potential role of exosomalmicrornas across gestation. J Clin Endocrinol Metab. 102 (9), 3182-3194 (2017).
  22. Knight, M., Redman, C. W., Linton, E. A., Sargent, I. L. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. Br J Obstet Gynaecol. 105 (6), 632-640 (1998).
  23. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and extracellular vesicles. Curr Hypertens Rep. 18 (9), 68 (2016).
  24. Dutta, S., et al. Hypoxia-induced small extracellular vesicle proteins regulate proinflammatory cytokines and systemic blood pressure in pregnant rats. Clin Sci (Lond). 134 (6), 593-607 (2020).
  25. Leon, J., et al. Disruption of the blood-brain barrier by extracellular vesicles from preeclampsia plasma and hypoxic placentae: attenuation by magnesium sulfate. Hypertension. 78 (5), 1423-1433 (2021).
  26. Han, C., et al. Placenta-derived extracellular vesicles induce preeclampsia in mouse models. Haematologica. 105 (6), 1686-1694 (2020).
  27. Amburgey, O. A., Chapman, A. C., May, V., Bernstein, I. M., Cipolla, M. J. Plasma from preeclamptic women increases blood-brain barrier permeability: role of vascular endothelial growth factor signaling. Hypertension. 56 (5), 1003-1008 (2010).
  28. Cipolla, M. J., et al. Pregnant serum induces neuroinflammation and seizure activity via TNFalpha. Exp Neurol. 234 (2), 398-404 (2012).
  29. Bergman, L., et al. Preeclampsia and increased permeability over the blood brain barrier – a role of vascular endothelial growth receptor 2. Am J Hypertens. 34 (1), 73-81 (2021).
  30. Torres-Vergara, P., et al. Dysregulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 phosphorylation is associated with disruption of the blood-brain barrier and brain endothelial cell apoptosis induced by plasma from women with preeclampsia. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (9), 166451 (2022).
  31. Schreurs, M. P., Houston, E. M., May, V., Cipolla, M. J. The adaptation of the blood-brain barrier to vascular endothelial growth factor and placental growth factor during pregnancy. FASEB J. 26 (1), 355-362 (2012).
  32. Schreurs, M. P., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction and blood-brain barrier permeability induced by oxidized LDL are prevented by apocynin and magnesium sulfate in female rats. J Cardiovasc Pharmacol. 63 (1), 33-39 (2014).
  33. Schreurs, M. P. H., et al. Increased oxidized low-density lipoprotein causes blood-brain barrier disruption in early-onset preeclampsia through LOX-1. FASEB J. 27 (3), 1254-1263 (2013).
  34. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. 80 (2), 242-256 (2023).
  35. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. Universities Federation of Animal Welfare. , (1959).
  36. Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
  37. Troncoso, F. A. J., Herlitz, K., Ruiz, F., Bertoglia, P., Escudero, C. Elevated pro-angiogenic phenotype in feto-placental tissue from gestational diabetes mellitus. Placenta. 36 (4), 2 (2015).
  38. Zhang, H. C., et al. Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (18), 3289-3297 (2012).
  39. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3), 22 (2006).
  40. Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), e13124 (2010).
  41. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988 (2021).
  42. Walchli, T., et al. Quantitative assessment of angiogenesis, perfused blood vessels and endothelial tip cells in the postnatal mouse brain. Nat Protoc. 10 (1), 53-74 (2015).
  43. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588 (2014).
  44. Morita, K., Sasaki, H., Furuse, M., Tsukita, S. Endothelial claudin: claudin-5/TMVCF constitutes tight junction strands in endothelial cells. J Cell Biol. 147 (1), 185-194 (1999).
  45. Lara, E., et al. Abnormal cerebral microvascular perfusion and reactivity in female offspring of reduced uterine perfusion pressure (RUPP) mice model. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (12), 2318-2332 (2022).
  46. Chang, X., et al. Exosomes from women with preeclampsia induced vascular dysfunction by delivering sflt (soluble fms-like tyrosine kinase)-1 and seng (soluble endoglin) to endothelial cells. Hypertension. 72, 1381-1390 (2018).
  47. Smarason, A. K., Sargent, I. L., Starkey, P. M., Redman, C. W. The effect of placental syncytiotrophoblast microvillous membranes from normal and pre-eclamptic women on the growth of endothelial cells in vitro. BJOG. 100 (10), 943-949 (1993).

Tags

Extracellular VesiclesBlood-brain BarrierPlacentaPreeclampsiaHypoxiaCerebrovascular ComplicationsMaternal MortalityBrain Endothelial Dysfunction
check_url/kr/65867?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sandoval, H., León, J., Troncoso, F., de la Hoz, V., Cisterna, A., Contreras, M., Castro, F. O., Ibañez, B., Acurio, J., Escudero, C. Disruption of the Mouse Blood-Brain Barrier by Small Extracellular Vesicles from Hypoxic Human Placentas. J. Vis. Exp. (203), e65867, doi:10.3791/65867 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image