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의학

저산소성 인간 태반의 작은 세포외 소포에 의한 생쥐 혈액-뇌 장벽의 파괴

Published: January 26, 2024
doi:
10.3791/65867
, , , , , , , , ,
1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences,Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty,Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department,Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine,Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences,Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

Summary

저산소 조건(자간전증의 한 측면 모델링)에서 배양된 태반 외식에서 분리된 소형 EV(sEV)가 임신하지 않은 성인 암컷 마우스의 혈액-뇌 장벽을 파괴하는지 여부를 평가하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

Abstract

뇌부종, 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중을 포함한 뇌혈관 합병증은 자간전증과 관련된 모성 사망의 주요 원인입니다. 이러한 뇌혈관 합병증의 근본적인 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 그러나 태반 기능 장애 및 혈액-뇌 장벽(BBB) 파괴와 관련이 있습니다. 그럼에도 불구하고, 멀리 떨어져 있는 이 두 기관 사이의 연관성은 여전히 밝혀지지 않고 있다. 태반이 세포외 소포를 포함한 신호 분자를 산모의 순환계로 방출한다는 증거가 늘어나고 있습니다. 세포외 소포체는 크기에 따라 분류되며, 작은 세포외 소포체(직경 200nm보다 작은 sEV)는 생리학적 및 병리학적 조건 모두에서 중요한 신호 전달 입자로 간주됩니다. 자간전증에서는 산모의 순환 sEV가 증가하는데, 이들의 신호 전달 기능은 잘 알려져 있지 않습니다. 자간전증 또는 저산소증에 노출된 정상 임신 태반에서 방출되는 태반 sEV는 뇌 내피 기능 장애와 BBB 파괴를 유발합니다. 이 프로토콜에서는 저산소 조건에서 배양된 태반 외식에서 분리된 sEV가 생체 내에서 BBB를 방해하는지 여부를 평가합니다.

Introduction

자간전증, 태반 과정 장애, 산모 전신 내피 기능 장애, 심한 경우 다발성 장기 부전을 특징으로 하는 고혈압성 임신 증후군으로 인한 산모 사망의 약 70%는 급성 뇌혈관 합병증과 관련이 있다 3,4. 대부분의 모성 사망은 저소득 및 중간소득 국가에서 발생한다5. 그러나 자간전증과 관련된 뇌혈관 합병증의 임상적, 역학적 관련성에도 불구하고 근본적인 메커니즘은 여전히 불분명하다.

반면에, 세포외 소포체(EV)(직경 ~30-400nm)는 산모-태반 상호작용을 포함하여 조직과 기관 간의 세포 간 통신에 필수적인 매개체이다6. 외부 표면의 단백질과 지질 외에도 EV는 내부에 화물(단백질, RNA 및 지질)을 운반합니다. EV는 (1) 엑소좀(직경 ~50-150nm, 소형 EV(sEV)이라고도 함), (2) 중형/대형 EV, (3) 세포사멸체로 분류할 수 있으며 크기, 생물 발생, 함량 및 잠재적 신호 전달 기능에 따라 다릅니다. EV의 구성은 EV가 유래한 세포와 질병 유형7에 의해 결정된다. 세포융합 영양 아세포 유래 EV는 임신 중 태반 유래 순환 소형 EV(PDsEV)를 검출하는 태반 알칼리성 인산가수분해효소(PLAP)8,9를 발현합니다. 또한 PLAP는 PDsEV 화물의 변화와 자간전증 대 정상 혈압 임신에서의 영향을 식별하는 데 도움이 됩니다 10,11,12,13,14,15.

태반은 자간전증(preeclampsia)16 또는 이 질병과 관련된 뇌 합병증(17,18,19)의 병태생리학에 필요한 요소로 인식되어 왔다. 그러나 이 멀리 떨어진 기관이 어떻게 뇌 순환의 변화를 유도할 수 있는지는 알려져 있지 않습니다. sEV는 생체 활성 성분을 기증자에서 수용 세포로 전달하는 능력으로 인해 세포 간 통신에서 중추적인 역할을 하기 때문에 6,20,21, 점점 더 많은 연구에서 태반 sEV를 뇌 내피 세포를 포함한 모계 내피 기능 장애21,22,23,24 생성과 연관시켰습니다25,26자간전증이 있는 여성. 따라서 뇌 내피 기능의 손상은 자간전증과 관련된 뇌혈관 합병증의 중요한 구성 요소인 혈액-뇌 장벽(BBB)의 파괴로 이어질 수 있습니다 3,27.

그럼에도 불구하고, 자간전증28 여성의 혈청에 노출된 쥐의 뇌혈관 또는 자간전증29 여성의 혈장에 노출된 인간 뇌 내피세포를 이용한 전임상 결과에서는 순환인자(순환인자)가 BBB의 파괴를 유도하는 것으로 보고되었다. 자간전증 동안 산모의 순환계에 존재하는 BBB에 해를 끼칠 가능성이 있는 여러 후보 물질에도 불구하고, 예를 들어 전염증성 사이토카인(즉, 종양괴사인자)18,28 또는 혈관 조절인자(즉, 혈관내피 성장인자(VEGF))29,30,31 또는 산화 지단백질(oxo-LDL)32,33과 같은 산화분자 등이 있다, 그들 중 어느 것도 태반과 BBB 사이에 직접적인 연결을 설정하지 않습니다. 최근에, 저산소성 태반으로부터 분리된 sEV는 임신하지 않은 암컷 마우스에서 BBB를 교란할 수 있는 능력을 보여주었다25. 태반 sEV는 BBB를 파괴할 수 있는 능력을 가진 나열된 순환 인자의 대부분을 운반할 수 있기 때문에 sEV는 손상된 태반을 연결하고 유해한 순환 인자의 운반자가 되며 자간전증에서 BBB를 파괴하는 데 적합한 후보로 간주됩니다.

이 프로토콜을 통해 저산소 조건에서 배양된 태반 외식에서 분리된 sEV가 자간전증 중 뇌 합병증의 병태생리를 이해하기 위한 대리물로서 임신하지 않은 암컷 마우스의 BBB를 방해할 수 있는지 여부를 조사할 수 있습니다.

Protocol

이 연구는 헬싱키 선언에 명시된 원칙에 따라 각 윤리 검토 위원회의 승인하에 수행되었습니다. 모든 인간 참가자는 이전에 보고된 바와 같이 샘플 수집 전에 정보에 입각한 동의를 제공했습니다25. 또한 Bío-Bío University의 생명 윤리 및 생물 안전위원회는이 프로젝트를 승인했습니다 (Fondecyt 보조금 1200250). 동물 연구는 실험에서 동물을 사용하는 데 있어 3R의 기본 원칙에 따라(<su…

Representative Results

이 프로토콜은 저산소증에서 배양된 태반에서 유래한 sEV가 임신하지 않은 마우스의 BBB를 방해하는 능력을 평가합니다. 이 방법을 사용하면 정상 및 병리학적 조건에서 태반과 뇌 사이의 잠재적인 연결을 더 잘 이해할 수 있습니다. 특히, 이 방법은 자간전증에서 뇌 합병증의 발병에 대한 태반 sEV의 참여를 분석하기 위한 대리물을 구성할 수 있다. sEVs-Nor를 주입한 마우스와 달…

Discussion

이 연구는 설치류의 혈액-뇌 장벽 파괴에 대한 저산소 조건에서 배양된 태반 외식에서 분리된 sEV로 인한 잠재적 피해에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 병리학적 기전은 후방 뇌 영역(25)에서 CLND-5의 감소를 수반한다.

선행 조사에 의하면 자간전증이 있는 개인의 혈장-sEV는 시험관 내 모델46,47을 사용하여…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자들은 귀중한 의견을 제시해 주신 GRIVAS Health 소속 연구원들에게 감사의 뜻을 전합니다. 또한 산부인과 서비스의 조산사와 임상 직원은 칠레 칠란 병원에 속해 있습니다. Fondecyt Regular 1200250에 의해 설립되었습니다.

Materials

Adult mice brain slecer matrice 3D printed Open access file Adult mice Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament.
Anti β-Actin primary antibody Sigma-Aldrich Clon AC-74 Antibody for loading control (Western blot)
Anti-Claudin5 primary antibody Santa cruz Biotechnology sc-374221 Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot)
BCA protein kit Thermo Scientific 23225 Kit for measuring protein concentration
Culture media #200 500 mL Thermo Fisher Scientific m200500 Culture media for placental explants
D180 CO2 incubator RWD Life science D180 Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor
Evans blue dye  > 75% 10 g Sigma-Aldrich E2129.10G Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO
Fetal bovine serum 500 mL Thermo Fisher Scientific 16000044 Additive growth factor for culture media 200
Himac Ultracentrifuge CP100NX Himac eppendorf group 5720410101 Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g
ImageJ software NIH https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 mL USP Baxter 212-094 Volatile inhalated anaesthesia agent for mice
Kit CellTiter 96 Non-radioactive  Promega 0000105232 In vitro assay for placental explants viability
Mouse IgG Secondary antibody Thermo Fisher Scientific MO 63103 Secondary antibody for CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300 Malvern Panalytical 90278090 Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL Thermo Fisher Scientific A11313.22 Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted)
PBS 1 X pH 7.4 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010023 Wash solution for placenta explants
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL Thermo Fisher Scientific 10378016 Antiobiotics for placental explants culture media
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller BioSpherix SCR_021131 CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 g Chemie 7061 humanitarian euthanasia agent
Somnosuite low flow anesthesia system Kent Scientifics SS-01 Isoflurane vaporizer for small rodents
Surgical Warming platform Kent Scientifics A41166 Warming platform for mainteinance anesthesia in mice
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm Southern labware 10026 Filtration of condicioned media harvested from placental explants 
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE Hitachi medical systems 6020 Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x  Center Medical 2597 Stereomicroscope to register brain slices
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Sandoval, H., León, J., Troncoso, F., de la Hoz, V., Cisterna, A., Contreras, M., Castro, F. O., Ibañez, B., Acurio, J., Escudero, C. Disruption of the Mouse Blood-Brain Barrier by Small Extracellular Vesicles from Hypoxic Human Placentas. J. Vis. Exp. (203), e65867, doi:10.3791/65867 (2024).
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