Ett protokoll presenteras för att utvärdera om små EV (sEV) isolerade från placenta-explantat odlade under hypoxiska förhållanden (modellering av en aspekt av havandeskapsförgiftning) stör blod-hjärnbarriären hos icke-dräktiga vuxna honmöss.
Cerebrovaskulära komplikationer, inklusive hjärnödem och ischemisk och hemorragisk stroke, utgör den främsta orsaken till mödradödlighet i samband med havandeskapsförgiftning. De bakomliggande mekanismerna för dessa cerebrovaskulära komplikationer är fortfarande oklara. De är dock kopplade till placentadysfunktion och störningar i blod-hjärnbarriären (BBB). Sambandet mellan dessa två avlägsna organ håller dock fortfarande på att fastställas. Allt fler bevis tyder på att moderkakan frigör signalmolekyler, inklusive extracellulära vesiklar, i moderns cirkulation. Extracellulära vesiklar kategoriseras efter deras storlek, med små extracellulära vesiklar (sEV mindre än 200 nm i diameter) som kritiska signalpartiklar vid både fysiologiska och patologiska tillstånd. Vid havandeskapsförgiftning finns det ett ökat antal cirkulerande sEV i moderns cirkulation, vars signalfunktion inte är väl förstådd. Placenta sEV som frigörs vid havandeskapsförgiftning eller från moderkakor under normal graviditet som utsätts för hypoxi inducerar endoteldysfunktion i hjärnan och störning av BBB. I detta protokoll bedömer vi om sEV isolerade från placenta-explantat odlade under hypoxiska förhållanden (modellering av en aspekt av preeklampsi) stör BBB in vivo.
Cirka 70 % av mödradödligheten på grund av havandeskapsförgiftning, ett hypertensivt graviditetssyndrom som kännetecknas av försämrade placenteringsprocesser, maternell systemisk endoteldysfunktion och, i allvarliga fall, multiorgansvikt 1,2, är förknippade med akuta cerebrovaskulära komplikationer 3,4. Den största delen av mödradödligheten inträffar i låg- och medelinkomstländer5. De bakomliggande mekanismerna är dock fortfarande oklara, trots den kliniska och epidemiologiska relevansen av cerebrovaskulära komplikationer i samband med havandeskapsförgiftning.
Å andra sidan är extracellulära vesiklar (EV) (diameter ~30-400 nm) viktiga mediatorer för intercellulär kommunikation mellan vävnader och organ, inklusive interaktion mellan moder och placenta6. Förutom proteiner och lipider på den yttre ytan bär EV last inuti (proteiner, RNA och lipider). EV kan kategoriseras i (1) exosomer (diameter ~50-150 nm, även kallade små EV (sEV)), (2) medelstora/stora EV och (3) apoptotiska kroppar, som skiljer sig åt i storlek, biogenes, innehåll och potentiell signalfunktion. Sammansättningen av EV bestäms av de celler som de kommer från och sjukdomstypen7. Syncytiotrofoblast-härledda EV uttrycker placenta alkaliskt fosfatas (PLAP)8,9, som detekterar placentae-härledda cirkulerande små EV (PDsEV) under graviditeten. PLAP hjälper också till att urskilja förändringar i PDsEVs last och deras effekter vid havandeskapsförgiftning kontra normotensiva graviditeter 10,11,12,13,14,15.
Moderkakan har erkänts som den nödvändiga komponenten i patofysiologin för preeklampsi16 eller cerebrala komplikationer i samband med denna sjukdom 17,18,19. Hur detta avlägsna organ kan inducera förändringar i hjärnans cirkulation är dock okänt. Eftersom sEV spelar en avgörande roll i cell-till-cell-kommunikation på grund av deras förmåga att överföra bioaktiva komponenter från donator- till mottagarceller 6,20,21, har ett växande antal studier associerat placenta-sEV med generering av moderns endoteldysfunktion 21,22,23,24, inklusive endotelceller i hjärnan 25,26hos kvinnor med havandeskapsförgiftning. Således kan komprometteringen av hjärnans endotelfunktion leda till störningar i blod-hjärnbarriären (BBB), en kritisk komponent i cerebrovaskulära komplikationer i samband med havandeskapsförgiftning 3,27.
Prekliniska fynd med cerebrala kärl hos råtta som exponerats för serum från kvinnor med preeklampsi28 eller endotelceller från human hjärna som exponerats för plasma från kvinnor med preeklampsi29 rapporterade dock att cirkulerande faktorer inducerar störning av BBB. Trots flera kandidater med potential att skada BBB som finns i moderns cirkulation under preeklampsi, såsom förhöjda nivåer av proinflammatoriska cytokiner (dvs. tumörnekrosfaktor)18,28 eller vaskulära regulatorer (dvs. vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF)))29,30,31, eller oxidativa molekyler såsom oxiderade lipoproteiner (oxo-LDL)32,33, bland annat34, ingen av dem visar att det finns ett direkt samband mellan moderkakan och BBB. Nyligen har sEV isolerat från hypoxiska moderkakor visat förmågan att störa BBB hos icke-dräktiga honmöss25. Eftersom sEV med moderkakan kan bära de flesta av de listade cirkulerande faktorerna med kapacitet att störa BBB, anses sEV vara lämpliga kandidater för att ansluta den skadade moderkakan, vara bärare av skadliga cirkulerande faktorer och störa BBB vid havandeskapsförgiftning.
Detta protokoll gör det möjligt för oss att undersöka om sEV isolerade från placenta-explantat odlade under hypoxiska förhållanden kan störa BBB hos icke-dräktiga honmöss som en proxy för att förstå patofysiologin för cerebrala komplikationer under preeklampsi.
Denna studie avslöjar nya insikter om potentiella skador till följd av sEV isolerade från placenta-explantat odlade under hypoxiska förhållanden på störningen av gnagarblod-hjärnbarriären. Den patologiska mekanismen innebär en minskning av CLND-5 i den bakre hjärnregionen25.
Tidigare undersökningar har visat att plasma-sEV från individer med havandeskapsförgiftning inducerar endoteldysfunktion i olika organ med hjälp av in vitro-modeller <sup cla…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka forskarna som tillhör GRIVAS Health för deras värdefulla bidrag. Även barnmorskor och klinisk personal från obstetrik och gynekologi tillhör Hospital de Chillan, Chile. Grundat av Fondecyt Regular 1200250.
Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |