연수막 림프 내피 세포의 수확 및 1차 배양

요약

최근에 확인된 두개내 세포 유형인 연수막 림프 내피 세포(LEC)는 기능이 잘 이해되지 않습니다. 이 연구는 마우스에서 LLEC를 수확하고 시험관 내 1차 배양을 확립하기 위한 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 연구자들이 LLEC의 세포 기능과 잠재적인 임상적 영향을 탐구할 수 있도록 설계되었습니다.

초록

연수막 림프 내피 세포(LEC)는 최근에 발견된 두개내 세포 집단으로, 말초 림프 내피 세포와 명확하게 구별되는 독특한 분포를 가지고 있습니다. 그들의 세포 기능과 임상적 의미는 거의 알려지지 않았습니다. 결과적으로, LLEC의 공급은 체외에서 기능적 연구를 수행하는 데 필수적입니다. 그러나 현재 시험관 내에서 LLEC를 수확하고 배양하기 위한 기존 프로토콜은 없습니다.

이 연구는 플라스크를 피브로넥틴으로 코팅하고, 현미경을 사용하여 렙토메닝을 해부하고, 렙토메닝을 효소로 소화하여 단세포 현탁액을 준비하고, 혈관 내피 성장 인자-C(VEGF-C)로 LLEC의 확장을 유도하고, 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 통해 림프관 히알루론산 수용체-1(LYVE-1) 양성 세포를 선택하는 등 다단계 프로토콜을 사용하여 LLEC를 성공적으로 수확했습니다. 이 과정은 궁극적으로 1차 문화의 확립으로 이어졌다. LLEC의 순도는 면역형광 염색 및 유세포 분석을 통해 확인되었으며, 순도는 95%를 초과했습니다. 이 다단계 프로토콜은 재현성과 타당성을 입증했으며, 이는 LLEC의 세포 기능 및 임상적 의미에 대한 탐구를 크게 촉진할 것입니다.

서론

새로 발견된 렙토메닝 림프 내피 세포(LEC)는 렙토메닝 내에서 개별 세포의 그물망을 형성하여 말초 림프 내피 세포와 비교할 때 뚜렷한 분포 패턴을 나타냅니다 ^1,2. LLEC와 관련된 세포 기능 및 임상적 의미는 여전히 미지의 영역으로 남아 있습니다. LLEC에 대한 기능적 연구의 길을 닦기 위해서는 연구를 위한 체외 모델을 확립하는 것이 필수적입니다. 따라서 본 연구는 LLEC의 격리 및 1차 배양에 대한 포괄적인 프로토콜을 고안했습니다.

마우스는 질병 연구에서 유전자 조작에 적합하기 때문에 선호되는 동물 모델입니다. 이전 연구에서는 림프절³, 장간막 조직⁴, 피부 조직⁵, 수집 림프관⁶ 및 폐 조직⁷을 포함한 다양한 마우스 조직에서 림프 내피 세포를 성공적으로 분리했습니다. 이러한 분리 절차는 주로 자기 활성화 세포 분류(MACS) 및 유세포 분석

프로토콜

본 연구는 쿤밍의과대학 동물실험윤리위원회(kmmu20220945)의 승인을 받았다. 모든 실험은 확립된 동물 관리 지침을 준수했습니다. 연수막 림프 내피 세포(LEC)는 6-8주 되고 체중이 20-25g인 수컷 C57Bl/6J 마우스로부터 수확했습니다. 이 쥐들은 중국 쿤밍에 있는 쿤밍 의과대학에서 조달했다. 전체 실험 절차는 엄격한 멸균 조건에서 수행되었습니다. 모든 원심분리 단계는 달리 명시되지 않는 한 실온에서 수행됩니다.

1. 시약 및 기구 준비

알림: 용액과 관련된 모든 단계는 클래스 II 생물학적 위험 캐비닛 내에서 수행해야 합니다.

1. 인산염 완충 식염수(PBS)를 칼슘 및 마그네슘, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(P/S)과 혼합하여 세척 완충액을 준비합니다( 재료 표 참조). 이 버퍼를 4°C에서 차갑게 유지하십시오. 사용 당일에 신선하게 준비하고 완충액의 가스를 제거하는 것이 중요합니다.
2. 10mL의 PBS(칼슘 및 마그네슘 제외)를 0.25% 트립신 2mL, 20mg/mL 파파인 1mL, 1mg/mL 콜라겐분해효소 I 200μL와 결합하여 소화 효소를 ....

결과

이 연구는 생쥐에서 림프 내피 세포(LEC)를 채취한 후 시험관 내에서 1차 배양을 확립하기 위한 재현 가능한 다단계 프로토콜을 제시합니다. 주요 단계에는 플라스크 준비 및 피브로넥틴 코팅, 렙토메닝의 해리, 효소 분해를 통한 단세포 현탁액 획득, VEGF-C로 LLEC 확장 유도가 포함됩니다. 그런 다음 LYVE-1 양성 LLEC를 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 사용하여 선택적으로 분리합니다. 마지막으로, 면역형광 염색 및 유세포 분석을 수행하여 LLEC의 순도를 평가하며, MTT 분석 결과는 강력한 LLECs 성장률을 보여줍니다(보충 그림 1). 이 다중 절차 프로토콜의 기본 단계는 순서도에 나와 있으며 전체 프로세스는 약 2-3주가 소요됩니다(그림 1).

LLEC를 수확하기 위해서는 렙토메닝을 해리하고 LLEC의 확장을 촉진하는 동시에 효율적인 수술 기법을 통해 세포 생.......

토론

시험관 내에서 LLEC를 수확하고 배양하기 위한 기존 프로토콜은 이전에 보고된 적이 없습니다. 이 연구는 마우스 렙토메닝에서 LLEC를 수확하고 배양하기 위한 재현 가능한 다중 절차 프로토콜을 소개합니다.

이 다중 절차 프로토콜은 재현 가능하지만 몇 가지 주요 고려 사항이 있습니다. 예를 들어, 피브로넥틴 코팅된 T25 플라스크는 비부착 세포를 제거함으로써 LLEC의 접착과 기능을 촉진하여 보다 균질한 세포 집단을 보장합니다. 또한 렙토메닝을 해리하기 위한 수술 절차 중 시간과 온도는 세포 생존력에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 따라서 지속 시간을 1시간 이내로 유지하고 버퍼를 충분히 차갑게 유지하는 것이 중요합니다. 또 다른 중요한 점은 렙토메닝에 적혈구가 존재한다는 것인데, 이로부터 헤모글로빈의 방출이 LLEC에 해를 끼칠 수 있습니다. 이를 완화하려면 적혈구를 부드럽게 씻어내고 씻어 적혈구를 제거하여 세포 독성 효과를 예방하는 것이 중요합니다. 마지막으로.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
블록 버퍼	Beyotime	P0102	부분 표본 저장 – 4 ° C
콜라겐 분해 효소 I	Solarbio	C8140	&ndash에 부분 표본 저장; 20 > C
DAPI	Beyotime	P0131	&ndash에 부분 표본 저장; 20 > C
DMEM	Solarbio	11995	&ndash에 부분 표본 저장; 4 ° C
D-PBS	Solarbio	D1041	&ndash에 부분 표본 저장; 4 ° C
EGM-2 MV 총알 키트	Lonza	C-3202	&ndash에 부분 표본을 보관하십시오. 4 ° C
FBS	Solarbio	S9010	매장 분취량은 – 20 > C
피브로넥틴	솔라바이오	F8180	분취량은 – 20 > C
FlowJo Software	BD Biosciences	V10.8.1
LYVE-1 항체	eBioscience	12-0443-82	분취액 저장 – 4 ° C
자기 분리기	Miltenyi	130-042-302	사용 전 멸균
자기 분리기 스탠드	Miltenyi	130-042-303	사용 전 멸균
Microbeads	Miltenyi	130-048-801	&ndash에 부분 표본을 보관하십시오. 4 ° C
P/S	Solarbio	P1400	분취량 – 20 > C
Papain	Solarbio	G8430-25g	매장 분취액 – 20 > C
PBS	Solarbio	D1040	&ndash에 부분 표본 저장; 4 ° C
PDPN 항체	산타	sc-53533	분취액 저장 – 4 ° C
PFA	Solarbio	P1110	&ndash에 부분 표본 저장; 4 ° C
PROX1 항체	Santa	sc-81983	분취액 – 4 ° C
선택 열	Miltenyi	130-042-401	사용 전 멸균
Trypsin	Gibco 25200072		&ndash에 부분 표본을 보관하십시오. 20 > C
VEGF-C	Abcam	ab51947	&ndash에 부분 표본 저장; 20 > C
VEGFR-3 항체	Santa	sc-514825	분취액 – 4 ° 씨