Høst og primær kultur af leptomeningeal lymfeceller
Summary
Leptomeningeal lymfatiske endotelceller (LLEC’er), en nyligt identificeret intrakraniel celletype, har dårligt forståede funktioner. Denne undersøgelse præsenterer en reproducerbar protokol til høst af LLEC’er fra mus og etablering af in vitro primære kulturer. Denne protokol er designet til at gøre det muligt for forskere at dykke ned i de cellulære funktioner og potentielle kliniske konsekvenser af LLEC’er.
Abstract
Leptomeningeal lymfatiske endotelceller (LLEC’er) er en nyligt opdaget intrakraniel cellulær population med en unik fordeling, der klart adskiller sig fra perifere lymfeendotelceller. Deres cellulære funktion og kliniske implikationer forbliver stort set ukendte. Tilgængeligheden af LLEC’er er derfor afgørende for at udføre funktionel forskning in vitro. Der findes dog i øjeblikket ingen eksisterende protokol for høst og dyrkning af LLEC’er in vitro.
Denne undersøgelse høstede LLEC’er med succes ved hjælp af en flertrinsprotokol, som omfattede belægning af kolben med fibronectin, dissekering af leptomeninges ved hjælp af et mikroskop, enzymatisk fordøjelse af leptomeninges for at forberede en enkeltcellesuspension, inducering af udvidelsen af LLEC’er med vaskulær endotelvækstfaktor-C (VEGF-C) og udvælgelse af lymfekarhyaluronreceptor-1 (LYVE-1) positive celler gennem magnetisk aktiveret cellesortering (MACS). Denne proces førte i sidste ende til etableringen af en primær kultur. Renheden af LLEC’erne blev bekræftet gennem immunofluorescensfarvning og flowcytometrisk analyse med et renhedsniveau på over 95%. Denne flertrinsprotokol har demonstreret reproducerbarhed og gennemførlighed, hvilket i høj grad vil lette udforskningen af LLEC’ernes cellulære funktion og kliniske implikationer.
Introduction
De nyopdagede leptomeningeale lymfatiske endotelceller (LLEC’er) danner et maskeværk af individuelle celler i leptomeninges, der udviser et tydeligt fordelingsmønster sammenlignet med perifere lymfatiske endotelceller 1,2. De cellulære funktioner og kliniske implikationer forbundet med LLEC’er forbliver stort set ukendt territorium. For at bane vejen for funktionel forskning i LLEC’er er det bydende nødvendigt at etablere en in vitro-model for deres undersøgelse. Derfor har denne undersøgelse udarbejdet en omfattende protokol for LLEC’ers isolation og primære kultur.
Mus er den foretrukne dyremodel på grund af deres egnethed til genetisk manipulation i sygdomsforskning. Tidligere undersøgelser har med succes isoleret lymfatiske endotelceller fra forskellige musevæv, herunder lymfeknuder3, mesenterialvæv4, dermalt væv5, indsamling af lymfeknuder6 og lungevæv7. Disse isolationsprocedurer har primært været afhængige af teknikker som magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) og flowcytometrisortering 8,9,10. Derudover har forskningsindsatsen ført til etablering af rottearachnoide cellelinjer og rottelymfatiske kapillærcellelinjer11,12. På trods af eksistensen af explantagekulturteknikker for leptomeninges13 er der et presserende behov for en standardiseret protokol for isolering og dyrkning af LLEC’er. Derfor har denne undersøgelse med succes høstet og dyrket LLEC’er ved omhyggeligt at adskille leptomeninges under vejledning af et mikroskop og fremme LLECs ekspansion gennem anvendelse af vaskulær endotelvækstfaktor-C (VEGF-C). Den karakteristiske markør for lymfatiske endotelceller er lymfekarhyaluronreceptor-1 (LYVE-1)14. Denne flertrinsprotokol isolerer selektivt LYVE-1-positive LLEC’er ved hjælp af MACS og verificerer derefter deres renhed gennem flowcytometrisk analyse og immunofluorescerende farvning.
De primære trin i denne flertrinsprotokol kan opsummeres som følger: kolbebelægning, dissociation af leptomeninges, enzymatisk fordøjelse af leptomeninges, celleudvidelse, magnetisk celleudvælgelse og efterfølgende dyrkning af LLEC’er. Endelig bekræftes renheden af de isolerede LLEC’er gennem flowcytometrisk analyse og immunofluorescerende farvning. Det overordnede mål med denne undersøgelse er at præsentere en reproducerbar, flertrinsprotokol til isolering af LLEC’er fra museleptomeninges og deres efterfølgende in vitro-kultur . Denne protokol er klar til i høj grad at lette undersøgelser af de cellulære funktioner og kliniske konsekvenser af LLEC’er.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den eksisterende protokol for høst og dyrkning af LLEC’er in vitro er ikke tidligere rapporteret. Denne undersøgelse introducerer en reproducerbar, multiproceduremæssig protokol til høst og dyrkning af LLEC’er fra museleptomeninges.
Selv om denne multiprocedureprotokol er reproducerbar, er der flere vigtige overvejelser. For eksempel fremmer fibronectinbelagte T25-kolber vedhæftningen af LLEC’er og funktion ved at eliminere ikke-klæbende celler og derved sikre en mere homogen ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Undersøgelsen blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81960226, 81760223), Natural Science Foundation of Yunnan Province (202001AS070045, 202301AY070001-011) og Scientific Research Foundation of Yunnan Province Department of Education (2023Y0784).
Materials
| Block buffer | Beyotime | P0102 | Store aliquots at –4 °C |
| Collagenase I | Solarbio | C8140 | Store aliquots at –20 °C |
| DAPI | Beyotime | P0131 | Store aliquots at –20 °C |
| DMEM | Solarbio | 11995 | Store aliquots at –4 °C |
| D-PBS | Solarbio | D1041 | Store aliquots at –4 °C |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | C-3202 | Store aliquots at –4 °C |
| FBS | Solarbio | S9010 | Store aliquots at –20 °C |
| Fibronectin | Solarbio | F8180 | Store aliquots at –20 °C |
| FlowJo Software | BD Biosciences | V10.8.1 | |
| LYVE-1 antibody | eBioscience | 12-0443-82 | Store aliquots at –4 °C |
| Magnetic separator | Miltenyi | 130-042-302 | Sterile before use |
| Magnetic separator stand | Miltenyi | 130-042-303 | Sterile before use |
| Microbeads | Miltenyi | 130-048-801 | Store aliquots at –4 °C |
| P/S | Solarbio | P1400 | Store aliquots at –20 °C |
| Papain | Solarbio | G8430-25g | Store aliquots at –20 °C |
| PBS | Solarbio | D1040 | Store aliquots at –4 °C |
| PDPN antibody | Santa | sc-53533 | Store aliquots at –4 °C |
| PFA | Solarbio | P1110 | Store aliquots at –4 °C |
| PROX1 antibody | Santa | sc-81983 | Store aliquots at –4 °C |
| Selection column | Miltenyi | 130-042-401 | Sterile before use |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGF-C | Abcam | ab51947 | Store aliquots at –20 °C |
| VEGFR-3 antibody | Santa | sc-514825 | Store aliquots at –4 °C |
References
- Shibata-Germanos, S., et al. Structural and functional conservation of non-lumenized lymphatic endothelial cells in the mammalian leptomeninges. Acta Neuropathologica. 139 (2), 383-401 (2020).
- Suárez, I., Schulte-Merker, S. Cells with many talents: lymphatic endothelial cells in the brain meninges. Cells. 10 (4), 799 (2021).
- Jordan-Williams, K. L., Ruddell, A. Culturing purifies murine lymph node lymphatic endothelium. Lymphatic Research and Biology. 12 (3), 144-149 (2014).
- Jones, B. E., Yong, L. C. Culture and characterization of bovine mesenteric lymphatic endothelium. In vitro Cellular & Developmental Biology. 23 (10), 698-706 (1987).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Jablon, K. L., et al. Isolation and short-term culturing of primary lymphatic endothelial cells from collecting lymphatics: A techniques study. Microcirculation. 30 (2-3), e12778 (2023).
- Lapinski, P. E., King, P. D. Isolation and culture of mouse lymphatic endothelial cells from lung tissue. Methods in Molecular Biology. 2319, 69-75 (2021).
- Lokmic, Z. Isolation, Identification, and culture of human lymphatic endothelial cells. Methods in Molecular Biology. 1430, 77-90 (2016).
- Thiele, W., Rothley, M., Schmaus, A., Plaumann, D., Sleeman, J. Flow cytometry-based isolation of dermal lymphatic endothelial cells from newborn rats. Lymphology. 47 (4), 177-186 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting. Journal of Visualized Experiments. 99, e52691 (2015).
- Janson, C., Romanova, L., Hansen, E., Hubel, A., Lam, C. Immortalization and functional characterization of rat arachnoid cell lines. 신경과학. 177, 23-34 (2011).
- Romanova, L. G., Hansen, E. A., Lam, C. H. Generation and preliminary characterization of immortalized cell line derived from rat lymphatic capillaries. Microcirculation. 21 (6), 551-561 (2014).
- Park, T. I., et al. Routine culture and study of adult human brain cells from neurosurgical specimens. Nature Protocols. 17 (2), 190-221 (2022).
- Okuda, K. S., et al. lyve1 expression reveals novel lymphatic vessels and new mechanisms for lymphatic vessel development in zebrafish. Development. 139 (13), 2381-2391 (2012).
- Bokobza, C., et al. Magnetic Isolation of microglial cells from neonate mouse for primary cell cultures. Journal of Visualized Experiments. 185, e62964 (2022).
- Wang, J. M., Chen, A. F., Zhang, K. Isolation and primary culture of mouse aortic endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. 118, e52965 (2016).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. The American Journal of Pathology. 154 (2), 385-394 (1999).
- Petrova, T. V., Koh, G. Y. Organ-specific lymphatic vasculature: From development to pathophysiology. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 35-49 (2018).
- Wilting, J., et al. The transcription factor Prox1 is a marker for lymphatic endothelial cells in normal and diseased human tissues. The FASEB Journal. 16 (10), 1271-1273 (2002).
- Yin, X., et al. Lymphatic endothelial heparan sulfate deficiency results in altered growth responses to vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C). The Journal of Biological Chemistry. 286 (17), 14952-14962 (2011).
- DeSisto, J., et al. Single-cell transcriptomic analyses of the developing meninges reveal meningeal fibroblast diversity and function. Developmental Cell. 54 (1), 43-59 (2020).
- Chen, Z., et al. A method for eliminating fibroblast contamination in mouse and human primary corneal epithelial cell cultures. Current Eye Research. , 1-11 (2023).
- Starzonek, C., et al. Enrichment of human dermal stem cells from primary cell cultures through the elimination of fibroblasts. Cells. 12 (6), 949 (2023).
- Lam, C. H., Romanova, L., Hubel, A., Janson, C., Hansen, E. A. The influence of fibroblast on the arachnoid leptomeningeal cells in vitro. Brain Research. 1657, 109-119 (2017).
