지주막하 출혈 후 뇌 절편에서 Vital and Non-vital Brain Pericytes 이미징

요약

예비 조사 결과 지주막하 출혈(SAH)이 뇌 주위 세포 사멸을 유발한다는 사실이 확인되었습니다. SAH 후 세포주위 수축성을 평가하려면 생존 가능한 뇌 주피세포와 생존 불가능한 뇌 주피를 구별해야 합니다. 따라서 뇌 절편에서 생존 가능한 뇌 주피세포와 생존 불가능한 뇌 주위 세포를 동시에 라벨링하는 절차가 개발되어 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 관찰을 용이하게 합니다.

초록

주위 세포는 대뇌 미세 순환 내에 위치한 중요한 벽화 세포로, 수축성 조절을 통해 대뇌 혈류를 능동적으로 조절하는 데 중추적인 역할을 합니다. 일반적으로 수축성은 특정 상황에서 형태학적 변화와 인근 모세관 직경 변화를 관찰하여 측정됩니다. 그러나 조직 후 고정, 활력 평가 및 이미징된 뇌 주위 세포의 주위 세포 수축성이 손상됩니다. 마찬가지로, 뇌 주위 세포를 유전적으로 표지하는 것은 생존 가능한 주위 세포와 생존 불가능한 주위 세포를 구별하는 데 부족하며, 특히 지주막하 출혈(SAH)과 같은 신경학적 상태에서는 예비 조사에서 뇌 주위 세포의 사멸을 입증합니다. 이러한 제약을 극복하기 위해 신뢰할 수 있는 프로토콜이 고안되어 뇌 절편에서 기능적 및 비기능적 뇌 주위 세포의 동시 형광 태깅을 가능하게 합니다. 이 표지 방법을 사용하면 고해상도 컨포칼 현미경을 시각화하여 뇌 절편 미세혈관을 동시에 표시할 수 있습니다. 이 혁신적인 프로토콜은 뇌 주위 세포 수축성, 모세혈관 직경에 미치는 영향 및 주위 세포 구조를 평가할 수 있는 수단을 제공합니다. SAH 맥락에서 뇌 주위 세포 수축성을 조사하면 대뇌 미세 순환에 미치는 영향을 통찰력 있게 이해할 수 있습니다.

서론

가느다란 돌기와 돌출된 세포체로 구별되는 뇌 주피세포는 미세순환 ^1,2를 둘러싸고 있습니다. 대뇌 혈류 확대는 주로 모세혈관 확장에 의해 이루어지지만, 동맥이 작을수록 확장 속도가 느려진다³. 주위 수축력은 모세혈관 직경과 주위 세포 형태에 영향을 미쳐 혈관 역학에 영향을 미친다⁴. 뇌 주위세포의 수축은 모세혈관 수축을 유발하며, 병리학적 시나리오에서 과도한 수축은 적혈구 흐름을 방해할 수 있다⁵. 유전자좌(locus coeruleus)에서 분비되는 노르에피네프린(norepinephrine)을 포함한 다양한 요인이 모세혈관 내에서 뇌주위 세포 수축을 유도할 수 있다⁶. 대뇌 혈류를 조절하는 역할을 하는 pericyte는 20-HETE 합성을 나타내며 과산소증⁷ 동안 산소 센서 역할을 한다. 산화-질화 스트레스로 유발된 뇌 주위 세포의 수축은 모세혈관에 해로운 영향을 미친다⁵. 뇌 주위 세포 수축에 대한 생체 내 및

프로토콜

실험 프로토콜은 쿤밍 의과대학 동물 윤리 및 사용 위원회(kmmu20220945)의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 남녀 모두의 Sprague-Dawley (SD) 쥐 (300-350 g)가 사용되었습니다.

1. SAH 모델 유도

1. 2% 이소플루란과 100% 산소를 사용하여 쥐를 마취합니다. 연속 흡입 마취에 이소플루란(1%-3%)을 공급하여 마취를 유지합니다. 입체 장치를 사용하여 쥐의 머리를 고정합니다( 재료 표 참조).
2. 아래 단계에 따라 SAH 모델을 만듭니다.
   1. 미세 주사 바늘을 suprasellar 수조에 삽입합니다. 그런 다음 주사기 펌프를 사용하여 쥐의 꼬리 동맥(항응고제 없음)에서 자가 혈액을 suprasellar 수조에 주입합니다( 재료 표 참조).
   2. 언급된 좌표를 사용하여 오른쪽 외측 뇌실에 미세 주입 바늘을 이식합니다: 브레그마, -0.8mm; 측면, 1.4mm; 깊이, 4mm⁹. SAH 그룹의 경우 쥐 꼬리 동맥혈 0.2mL를 주사합니다. 가짜 그룹의 경우 동일한 양의 등장성 식염수를 투여합니다(

결과

정상적인 생리학적 조건에서 뇌 주위세포는 일반적으로 세포 사멸을 겪지 않습니다. 그림 6 은 이 현상을 보여주며, 노란색은 중요한 뇌 주위 세포의 존재를 나타냅니다. 뇌 주위 세포는 PI로 염색되지 않아 생존 가능성을 나타냅니다. 세포 사멸 후 pericyte가 미세혈관에 부착된 상태로 남아 있는지 여부를 추가로 조사하기 위해 SAH 쥐 모델에 방법을 사용하고 후속 이미징을 수행했습니다.

SAH 후 뇌 절편에서 중요한 뇌 주위 세포와 비중요한 뇌 주위 세포를 모두 이미징하는 방법이 개발되었습니다. 그림 7에서 볼 수 있듯이 중요한 뇌 주위 세포(파란색 화살표)는 미세혈관 내에 위치하는 반면, 비필수 뇌 주위 세포는 흰색 화살표로 표시됩니다. 이 동시 시각화를 통해 뇌 절편 내에서 중요한 뇌 주위 세포와 비중요한 뇌 주위 세포를 모두 식별할 수 있습니다. 또한, PI 표지된 .......

토론

중요한 뇌 주위 세포, 비필수 뇌 주위 세포 및 뇌 절편의 미세혈관을 시각화하기 위한 고해상도 공초점 이미징 기술이 개발되었습니다. 급성 쥐 뇌 절편에서, 이 과정은 TO-PRO-3¹¹을 사용한 주위 세포의 초기 표지를 수반한 후 IB4¹²를 사용한 미세혈관 내피 세포를 수반합니다. 그 후, PI를 사용하여 죽은 pericyte의 식별이 수행됩니다. 이 프로토콜은 간단하고 재현 가능하며 기능 연구에 매우 적합합니다.

신경계 내의 뇌 주피세포를 특이적으로 추적하기 위해 원적색 형광단 TO-PRO-3가 사용됩니다. TO-PRO-3는 주로 고정 조직¹³의 핵을 염색하지만, 생리식염수¹⁴에 적용하면 생체 외 살아있는 주위 세포에 선택적으로 통합됩니다. 이전 연구에서는 TO-PRO-3^15.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6웰 플레이트	ABC 생화학	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
알루미늄 호일	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2· 2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
컨포칼 이미징 소프트웨어	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경	Nikon	N-SIM/C2si	RT
가스 탱크(5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
유리 바닥 컨포칼 접시	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
포도	시그마-알드리치	G5767	RT
접착제	EVOBOND	KH-502	RT
제빙기	XUEKE	IMS-20	RT
이미지 분석 소프트웨어	미국 국립보건원(National Institutes of Health	이미지 J	RT
흡입 마취 시스템	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectin B 4- FITC	SIGMA	L2895– 2MG	&ndash에 부분 표본을 저장하십시오. 20 > C
KCl	시그마-알드리치	7447– 40– 7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647– 14– 5	RT
NaH2PO4· H2O	시그마-알드리치	10049– 21– 5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
파스퇴르 피펫	NEST 생명공학	318314	RT
연동 펌프	Scientific Industries Inc	모델 203	RT
프로피듐(요오드화물)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	&ndash에 부분 표본 저장; 20 > C
입체 운동 장치	SCIENCE	QA	RT
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