इमेजिंग महत्वपूर्ण और गैर महत्वपूर्ण मस्तिष्क Pericytes Subarachnoid रक्तस्राव के बाद मस्तिष्क स्लाइस में
Summary
प्रारंभिक जांच से पुष्टि होती है कि सबराचोनोइड रक्तस्राव (एसएएच) मस्तिष्क पेरिसाइट निधन का कारण बनता है। पेरिसाइट सिकुड़न के बाद एसएएच का मूल्यांकन करने के लिए व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य मस्तिष्क पेरिसाइट्स के बीच भेदभाव की आवश्यकता होती है। इसलिए, मस्तिष्क वर्गों में समवर्ती रूप से व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य मस्तिष्क पेरिसाइट्स को लेबल करने के लिए एक प्रक्रिया विकसित की गई है, जो एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अवलोकन की सुविधा प्रदान करती है।
Abstract
पेरिसाइट्स सेरेब्रल माइक्रोकिरकुलेशन के भीतर स्थित महत्वपूर्ण भित्ति कोशिकाएं हैं, जो संकुचन समायोजन के माध्यम से मस्तिष्क रक्त प्रवाह को सक्रिय रूप से संशोधित करने में महत्वपूर्ण हैं। परंपरागत रूप से, विशिष्ट परिस्थितियों में रूपात्मक बदलाव और आस-पास केशिका व्यास परिवर्तनों को देखकर उनकी सिकुड़न का अनुमान लगाया जाता है। फिर भी, ऊतक निर्धारण के बाद, जीवन शक्ति का मूल्यांकन और इमेज्ड मस्तिष्क पेरिसाइट्स की आगामी पेरिसाइट सिकुड़न समझौता हो जाता है। इसी तरह, आनुवंशिक रूप से लेबलिंग मस्तिष्क पेरिसाइट्स व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य पेरिसाइट्स के बीच अंतर करने में कम हो जाता है, विशेष रूप से सबराचोनोइड रक्तस्राव (एसएएच) जैसी न्यूरोलॉजिक स्थितियों में, जहां हमारी प्रारंभिक जांच मस्तिष्क पेरिसाइट निधन को मान्य करती है। इन बाधाओं को दूर करने के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल तैयार किया गया है, जिससे मस्तिष्क वर्गों में कार्यात्मक और गैर-कार्यात्मक मस्तिष्क पेरिसाइट्स दोनों के एक साथ फ्लोरोसेंट टैगिंग सक्षम हो सके। इस लेबलिंग विधि उच्च संकल्प confocal माइक्रोस्कोप दृश्य की अनुमति देता है, समवर्ती मस्तिष्क टुकड़ा microvasculature अंकन. यह अभिनव प्रोटोकॉल मस्तिष्क पेरिसाइट सिकुड़न, केशिका व्यास और पेरिसाइट संरचना पर इसके प्रभाव का मूल्यांकन करने का एक साधन प्रदान करता है। एसएएच संदर्भ के भीतर मस्तिष्क पेरिसाइट सिकुड़न की जांच सेरेब्रल माइक्रोकिरकुलेशन पर इसके प्रभावों की व्यावहारिक समझ पैदा करती है।
Introduction
मस्तिष्क pericytes, उनके पतला protuberances और उभरे हुए सेल निकायों द्वारा प्रतिष्ठित, microcirculation 1,2 घेर. जबकि सेरेब्रल रक्त प्रवाह वृद्धि मुख्य रूप से केशिका फैलाव द्वारा संचालित होती है, छोटी धमनियां फैलाव की धीमी दर प्रदर्शित करती हैं3. पेरिसाइट सिकुड़न केशिका व्यास और पेरिसाइट आकृति विज्ञान पर प्रभाव डालती है, संवहनी गतिशीलता को प्रभावित करती है4. मस्तिष्क पेरिसाइट्स के संकुचन से केशिका कसना होता है, और रोग परिदृश्यों में, अत्यधिक संकुचन एरिथ्रोसाइट प्रवाह को बाधित कर सकता है5. लोकस कोरुलेस से जारी नॉरपेनेफ्रिन सहित विभिन्न कारक, केशिकाओं के भीतर मस्तिष्क पेरिसाइट संकुचन को प्रेरित कर सकते हैं6. सेरेब्रल रक्त प्रवाह में एक नियामक भूमिका के साथ, पेरिसाइट्स 20-एचईटीई संश्लेषण का प्रदर्शन करते हैं, जो हाइपरॉक्सिया7 के दौरान ऑक्सीजन सेंसर के रूप में कार्य करते हैं। मस्तिष्क पेरिसाइट्स के ऑक्सीडेटिव-नाइट्रेटिव तनाव-ट्रिगर संकुचन केशिकाओं को हानिकारक रूप से प्रभावित करता है5. मस्तिष्क पेरिसाइट संकुचन8 में विवो और पूर्व विवो जांच दोनों के बावजूद, मस्तिष्क स्लाइस के भीतर व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य मस्तिष्क पेरिसाइट्स की इमेजिंग के बारे में सीमित ज्ञान बनी रहती है।
महत्वपूर्ण रूप से, मस्तिष्क पेरिसाइट्स के पोस्ट-ऊतक निर्धारण इमेजिंग उनकी जीवन शक्ति और बाद में सिकुड़न मूल्यांकन से समझौता करते हैं। इसके अलावा, न्यूरोलॉजिकल विकारों (जैसे, सबराचोनोइड रक्तस्राव – एसएएच) जैसे परिदृश्यों में, मस्तिष्क पेरिसाइट्स की ट्रांसजेनिक लेबलिंग व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य पेरिसाइट्स के बीच अंतर करने में विफल रहती है, जैसा कि हमारे प्रारंभिक एसएएच-प्रेरित मस्तिष्क पेरिसाइट मृत्यु अध्ययन9 द्वारा पुष्टि की गई है।
इन चुनौतियों को दूर करने के लिए, हमने जीवित पेरिसाइट्स को लेबल करने के लिए टीओ-प्रो -3 को नियोजित किया, जबकि मृतक लोगों को प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) के साथ दाग दिया गया था। हम इमेजिंग के दौरान टुकड़ा गतिविधि को संरक्षित करते हुए मस्तिष्क स्लाइस में व्यवहार्य और गैर व्यवहार्य मस्तिष्क pericytes कल्पना करने के लिए उच्च संकल्प confocal इमेजिंग प्रौद्योगिकियों का इस्तेमाल किया. इस लेख का उद्देश्य मस्तिष्क स्लाइस में व्यवहार्य और गैर-व्यवहार्य मस्तिष्क पेरिसाइट्स इमेजिंग के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रस्तुत करना है, जो एसएएच के बाद मस्तिष्क माइक्रोकिरकुलेशन पर मस्तिष्क पेरिसाइट्स के प्रभाव की जांच करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में कार्य करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विकसित महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स, गैर-महत्वपूर्ण मस्तिष्क पेरिसाइट्स और मस्तिष्क स्लाइस में माइक्रोवास्कुलचर की कल्पना करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल इमेजिंग तकनीक हैं। तीव्र चूहे म?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81960226,81760223) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था; युन्नान प्रांत का प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
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