Obtención de imágenes de pericitos cerebrales vitales y no vitales en cortes de cerebro después de una hemorragia subaracnoidea

Summary

La investigación preliminar confirma que la hemorragia subaracnoidea (HSA) causa la muerte de los pericitos cerebrales. La evaluación de la contractilidad de los pericitos después de la HSA requiere la diferenciación entre pericitos cerebrales viables y no viables. Por lo tanto, se ha desarrollado un procedimiento para marcar pericitos cerebrales viables y no viables simultáneamente en secciones cerebrales, lo que facilita la observación utilizando un microscopio confocal de alta resolución.

Abstract

Los pericitos son células murales cruciales situadas dentro de la microcirculación cerebral, fundamentales para modular activamente el flujo sanguíneo cerebral a través de ajustes de contractilidad. Convencionalmente, su contractilidad se mide observando los cambios morfológicos y los cambios de diámetro capilar cercanos en circunstancias específicas. Sin embargo, la fijación posterior al tejido, la evaluación de la vitalidad y la consiguiente contractilidad pericitaria de los pericitos cerebrales de los que se obtienen imágenes se ven comprometidas. Del mismo modo, el etiquetado genético de los pericitos cerebrales se queda corto a la hora de distinguir entre pericitos viables y no viables, especialmente en afecciones neurológicas como la hemorragia subaracnoidea (HSA), donde nuestra investigación preliminar valida la desaparición de los pericitos cerebrales. Se ha diseñado un protocolo fiable para superar estas limitaciones, que permite el marcaje fluorescente simultáneo de pericitos cerebrales funcionales y no funcionales en secciones cerebrales. Este método de etiquetado permite la visualización al microscopio confocal de alta resolución, marcando simultáneamente la microvasculatura del corte de cerebro. Este innovador protocolo ofrece un medio para evaluar la contractilidad del pericito cerebral, su impacto en el diámetro capilar y la estructura del pericito. La investigación de la contractilidad de los pericitos cerebrales en el contexto de la HSA permite comprender mejor sus efectos sobre la microcirculación cerebral.

Introduction

Los pericitos cerebrales, que se distinguen por sus protuberancias delgadas y cuerpos celulares que sobresalen, rodean la microcirculación ^1,2. Mientras que el aumento del flujo sanguíneo cerebral es impulsado predominantemente por la dilatación capilar, las arterias más pequeñas exhiben tasas más lentas^{de dilatación}. La contractilidad pericitaria ejerce influencia sobre el diámetro capilar y la morfología pericitaria, impactando en la dinámica vascular⁴. La contracción de los pericitos cerebrales conduce a la constricción capilar y, en escenarios patológicos, la contracción excesiva puede impedir el flujo de eritrocitos⁵. Varios factores, incluida la norepinefrina liberada del locus coeruleus, pueden inducir la contracción de los pericitos cerebrales dentro de los capilares⁶. Con un papel regulador en el flujo sanguíneo cerebral, los pericitos exhiben síntesis de 20-HOTE, sirviendo como sensor de oxígeno durante la hiperoxia⁷. La contracción de los pericitos cerebrales provocada por el estrés oxidativo-nitrativo afecta negativamente a los capilares⁵. A pesar de las investigaciones in vivo y ex vivo sobre la contracción de los pericitos cerebrales⁸, persiste un conocimiento limitado con respecto a la obtención de imágenes de pericitos cerebrales viables y no viables dentro de cortes de cerebro.

De manera crucial, las imágenes posteriores a la fijación tisular de los pericitos cerebrales comprometen su vitalidad y la posterior evaluación de la contractilidad. Además, en escenarios como los trastornos neurológicos (p. ej., hemorragia subaracnoidea – HSA), el marcaje transgénico de los pericitos cerebrales no logra diferenciar entre pericitos viables y no viables, como lo confirma nuestro estudio preliminar de muerte de pericitos cerebrales inducida por HSA⁹.

Para superar estos desafíos, empleamos TO-PRO-3 para marcar pericitos vivos, mientras que los fallecidos se tiñeron con yoduro de propidio (PI). Utilizamos tecnologías de imágenes confocales de alta resolución para visualizar pericitos cerebrales viables y no viables en cortes de cerebro, al tiempo que preservamos la actividad de los cortes durante la obtención de imágenes. Este artículo tiene como objetivo presentar un método reproducible para obtener imágenes de pericitos cerebrales viables y no viables en cortes de cerebro, que sirva como una herramienta valiosa para investigar el impacto de los pericitos cerebrales en la microcirculación cerebral después de la HSA.

Protocol

El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética y Uso Animal de la Universidad Médica de Kunming (kmmu20220945). Para el presente estudio se utilizaron ratas Sprague-Dawley (SD) de ambos sexos, de 300-350 g. 1. Inducir el modelo SAH Anestesiar a las ratas con isoflurano al 2% y oxígeno al 100%. Mantener la anestesia suministrando anestesia inhalatoria continua con isoflurano (1%-3%). Asegure la cabeza de la rata con un aparato estereotáxico (consul…

Representative Results

En condiciones fisiológicas normales, los pericitos cerebrales generalmente no sufren muerte celular. La figura 6 ilustra este fenómeno, donde el amarillo indica la presencia de pericitos cerebrales vitales; Los pericitos cerebrales no muestran tinción con PI, lo que indica su viabilidad. Para investigar más a fondo si los pericitos permanecen unidos a la microvasculatura después de la muerte celular, se emplearon métodos en un modelo de rata SAH y se realizaron imágenes posteriores.<…

Discussion

Se han desarrollado técnicas de imagen confocal de alta resolución para visualizar los pericitos cerebrales vitales, los pericitos cerebrales no vitales y la microvasculatura en cortes cerebrales. En cortes agudos de cerebro de rata, el proceso implica el marcaje inicial de pericitos con TO-PRO-3¹¹, seguido de células endoteliales microvasculares con IB4¹²; posteriormente, se realiza la identificación de los pericitos fallecidos mediante PI. Este protocolo es sencillo, …

Materials

6-well plate	ABC biochemistry	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
Aluminium foil	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
Confocal imaging software	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
Confocal Laser Scanning Microscope	Nikon	N-SIM/C2si	RT
Gas tank (5% CO2, 95% O2)	PENGYIDA	40L	RT
Glass Bottom Confocal Dishes	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	RT
Glue	EVOBOND	KH-502	RT
Ice machine	XUEKE	IMS-20	RT
Image analysis software	National Institutes of Health	Image J	RT
Inhalation anesthesia system	SCIENCE	QAF700	RT
Isolectin B 4-FITC	SIGMA	L2895–2MG	Store aliquots at –20 °C
KCl	Sigma-Aldrich	7447–40–7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647–14–5	RT
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	10049–21–5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318314	RT
Peristaltic Pump	Scientific Industries Inc	Model 203	RT
Propidium (Iodide)	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	Store aliquots at –20 °C
Stereotaxic apparatus	SCIENCE	QA	RT
Syringe pump	Harvard PUMP	PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
Thermostatic water bath	OLABO	HH-2	RT
Vibrating microtome	Leica	VT1200	RT