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생화학

Espressione e purificazione ad alto rendimento di vettori di soluti umani per studi strutturali e biochimici

Published: September 29, 2023
doi:
10.3791/65878
, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine,University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Summary

Gli studi strutturali e biochimici dei trasportatori di membrana umani richiedono quantità di milligrammi di proteine stabili, intatte e omogenee. Qui descriviamo metodi scalabili per lo screening, l’espressione e la purificazione di trasportatori di soluti umani utilizzando geni ottimizzati per i codoni.

Abstract

I trasportatori di soluti (SLC) sono trasportatori di membrana che importano ed esportano una serie di substrati endogeni ed esogeni, tra cui ioni, nutrienti, metaboliti, neurotrasmettitori e prodotti farmaceutici. Nonostante sia emerso come interessanti bersagli terapeutici e marcatori di malattia, questo gruppo di proteine è ancora relativamente poco drogato dai farmaci attuali. I progetti di scoperta di farmaci per questi trasportatori sono ostacolati da limitate conoscenze strutturali, funzionali e fisiologiche, in ultima analisi a causa delle difficoltà nell’espressione e nella purificazione di questa classe di proteine incorporate nella membrana. Qui, dimostriamo i metodi per ottenere quantità di milligrammi ad alta purezza di proteine trasportatrici SLC umane utilizzando sequenze geniche ottimizzate per il codone. In combinazione con un’esplorazione sistematica della progettazione dei costrutti e dell’espressione ad alto rendimento, questi protocolli garantiscono la conservazione dell’integrità strutturale e dell’attività biochimica delle proteine bersaglio. Evidenziamo anche i passaggi critici nell’espressione delle cellule eucariotiche, nella purificazione dell’affinità e nella cromatografia ad esclusione dimensionale di queste proteine. In definitiva, questo flusso di lavoro produce preparazioni proteiche pure, funzionalmente attive e stabili adatte per la determinazione della struttura ad alta risoluzione, studi di trasporto, saggi di coinvolgimento di piccole molecole e screening in vitro ad alto rendimento.

Introduction

Le proteine di membrana sono state a lungo bersagli sia per i ricercatori che per le industrie farmaceutiche. Di questi, i trasportatori di soluti (SLC) sono una famiglia di oltre 400 geni trasportatori secondari codificati all’interno del genoma umano1. Questi trasportatori sono coinvolti nell’importazione e nell’esportazione di numerose molecole, tra cui ioni2, neurotrasmettitori3, lipidi 4,5,6,7, amminoacidi 8, nutrienti 9,10,11 e prodotti farmaceutici 12. Con una tale ampiezza di substrati, queste proteine sono anche implicate in una serie di fisiopatologie attraverso il trasporto di tossine13, il trasporto e l’inibizione da parte di droghe d’abuso 14,15 o mutazioni deleterie16. Gli omologhi batterici sono serviti come prototipi per il meccanismo di trasporto fondamentale di diverse famiglie di SLC 17,18,19,20,21,22,23,24,25. A differenza delle proteine umane, gli ortologhi procariotici sono spesso meglio espressi nel ben noto sistema di espressione di Escherichia coli 26,27 e sono più stabili nei detergenti più piccoli che producono cristalli ben ordinati per la cristallografia a raggi X28. Tuttavia, le differenze di sequenza e funzionali complicano l’uso di queste proteine lontanamente correlate per la scoperta di farmaci29,30. Di conseguenza, lo studio diretto della proteina umana è spesso necessario per decifrare il meccanismo d’azione dei farmaci che hanno come bersaglio le SLC 31,32,33,34,35. Mentre i recenti progressi nella microscopia crioelettronica (Cryo-EM) hanno permesso la caratterizzazione strutturale delle SLC in condizioni più simili a quelle native36,37, la difficoltà nell’esprimere e purificare queste proteine rimane una sfida per lo sviluppo di terapie e diagnostica mirate.

Per alleviare questa sfida, il consorzio RESOLUTE (re-solute.eu) ha sviluppato risorse e protocolli per l’espressione e la purificazione su larga scala delle proteine umane della famiglia SLC38. Partendo da geni ottimizzati per i codoni, abbiamo sviluppato metodi per il clonaggio e lo screening ad alto rendimento di costrutti SLC. Questi metodi sono stati sistematicamente applicati all’intera famiglia di SLC, i geni sono stati clonati nel sistema di espressione virale BacMam e l’espressione proteica è stata testata in linee cellulari umane39 sulla base di metodi precedentemente descritti per il clonaggio ad alto rendimento e il test di espressione40. In sintesi, il gene SLC viene clonato dal plasmide pDONR221 in un vettore pHTBV1.1. Questo costrutto viene successivamente utilizzato per trasporre il gene di interesse in un vettore bacmide per la trasfezione di cellule di insetto, che include un promotore del citomegalovirus e un elemento enhancer per l’espressione nelle cellule di mammifero. Il baculovirus risultante può essere utilizzato per trasdurre cellule di mammifero per l’espressione della proteina SLC bersaglio.

Abbiamo inoltre sviluppato metodi standardizzati per l’espressione su larga scala e la purificazione stabile di SLC selezionati (Figura 1). Questo protocollo include più punti di controllo per facilitare la risoluzione dei problemi e ridurre al minimo la variabilità tra gli esperimenti. In particolare, il monitoraggio di routine dell’espressione e della localizzazione delle proteine, nonché l’ottimizzazione su piccola scala delle condizioni di purificazione per i singoli bersagli, sono stati aiutati dai tag Strep e Green Fluorescent Protein (GFP)41,42.

In definitiva, questi campioni proteici chimicamente puri e strutturalmente omogenei possono essere utilizzati per la determinazione strutturale mediante cristallografia a raggi X o microscopia crioelettronica (Cryo-EM), saggi biochimici di coinvolgimento del bersaglio, immunizzazione per la generazione di leganti e studi funzionali privi di cellule tramite ricostituzione in liposomi chimicamente definiti.

Protocol

NOTA: Tutti i geni RESOLUTE SLC ottimizzati per codone sono stati depositati in AddGene43, i cui link sono disponibili nell’elenco dei reagenti pubblici RESOLUTE44. Questi geni sono stati clonati nel plasmide pDONR221 e consentono la clonazione diretta dei geni nel vettore di destinazione utilizzando la clonazione di ricombinazione45. Per massimizzare il parallelismo, le cellule batteriche, di insetto e di mammifero vengono coltivate in formato blocc…

Representative Results

I geni SLC possono essere clonati da plasmidi resolute pDONR in vettori BacMam per l’espressione nei mammiferiI protocolli descritti per il clonaggio, l’espressione e la purificazione si sono dimostrati efficaci per molti trasportatori SLC attraverso più ripiegamenti proteici. Tuttavia, le procedure includono diversi punti di controllo per il monitoraggio dei progressi, consentendo l’ottimizzazione per tenere conto delle differenze di espressione, ripiegamento delle proteine, stabilità dipendente d…

Discussion

Lo sviluppo di terapie mirate a SLC è rimasto ostacolato a causa dell’assenza di una caratterizzazione sistematica della funzione del trasportatore. Ciò ha portato a un numero sproporzionato di farmaci che hanno come bersaglio questa classe proteica rispetto ai GPCR e ai canali ionici63, nonostante i loro numerosi ruoli nei processi normali e fisiopatologici. RESOLUTE è un consorzio internazionale che mira a sviluppare tecniche e strumenti di ricerca all’avanguardia per accelerare e migliorare …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato svolto nell’ambito del progetto RESOLUTE. RESOLUTE ha ricevuto finanziamenti dall’impresa comune Iniziativa in materia di medicinali innovativi 2 nell’ambito dell’accordo di sovvenzione n. 777372. L’impresa comune riceve il sostegno del programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell’Unione europea e dell’EFPIA. Questo articolo riflette solo il punto di vista degli autori e né l’IMI né l’Unione europea e l’EFPIA sono responsabili per qualsiasi uso che possa essere fatto delle informazioni in esso contenute. Il plasmide pHTBV è stato gentilmente fornito dal Prof. Frederick Boyce (Harvard).

Materials

3C protease Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators Sartorius VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside Anatrace C325 CYMAL-5
96-well bacmid purification kit Millipore LSKP09604 Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL) Greiner Bio-One 780271
Adhesive plastic seals Qiagen 19570 Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse Produced in-house
BisTris Sigma Aldrich B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt Anatrace CH210 CHS
Cobalt metal affinity resin Takara Bio 635653 TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin Sigma Aldrich 851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column Cytiva 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin Apollo Scientific BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL) DWK Life Sciences 357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001 cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fos-Choline-12 Anatrace F308S FS-12
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Glyco-diosgenin Anatrace GDN101 GDN
Gravity flow columns Cole-Parmer WZ-06479-25
HEK293 medium Thermo Fisher 12338018 FreeStyle 293 medium
HEPES Apollo Scientific BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column Sepax 231300-4615 Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole Sigma Aldrich 56750
Insect transfection reagent Sigma Aldrich 71259 Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol Anatrace NG310 LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich M2670
Micro-expression shaker Glas-Col 107A DPMINC24CE
NaCl Sigma Aldrich S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside Anatrace D322 DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside Anatrace D310 DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide Anatrace D360 LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside Anatrace O311D OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		 Anatrace O330 C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol Anatrace NG311 OGNG
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537 DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether Anatrace AP1210 C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether Anatrace APO129 C12E9
Porous seal for tissue culture plates VWR 60941-084 Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Recombination enzyme mix Thermo Fisher 11791020 Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media Gibco 10902088 Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate Sigma Aldrich 303410
Sonicator 24-head probe Sonics 630-0579
Sonicator power unit Sonics VCX 750
Strep-Tactin resin IBA Life Sciences 2-5030-025 Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350 DDS
Suspension-adapted HEK293 cells Thermo Fisher A14527 Expi293F
Transfection reagent Sigma Aldrich 70967 GeneJuice Transfection Reagent
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Raturi, S., Li, H., Chang, Y., Scacioc, A., Bohstedt, T., Fernandez-Cid, A., Evans, A., Abrusci, P., Balakrishnan, A., Pascoa, T. C., He, D., Chi, G., Kaur Singh, N., Ye, M., Li, A., Shrestha, L., Wang, D., Williams, E. P., Burgess-Brown, N. A., Dürr, K. L., Puetter, V., Ingles-Prieto, A., Sauer, D. B. High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies. J. Vis. Exp. (199), e65878, doi:10.3791/65878 (2023).
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