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생화학

Expresión y purificación de alto rendimiento de portadores de solutos humanos para estudios estructurales y bioquímicos

Published: September 29, 2023
doi:
10.3791/65878
, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine,University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Summary

Los estudios estructurales y bioquímicos de los transportadores de membrana humana requieren cantidades de miligramos de proteína estable, intacta y homogénea. Aquí describimos métodos escalables para seleccionar, expresar y purificar transportadores de solutos humanos utilizando genes optimizados para codones.

Abstract

Los transportadores de solutos (SLC) son transportadores de membrana que importan y exportan una variedad de sustratos endógenos y exógenos, incluidos iones, nutrientes, metabolitos, neurotransmisores y productos farmacéuticos. A pesar de haber surgido como dianas terapéuticas atractivas y marcadores de enfermedades, este grupo de proteínas sigue estando relativamente infradrogado por los productos farmacéuticos actuales. Los proyectos de descubrimiento de fármacos para estos transportadores se ven obstaculizados por el limitado conocimiento estructural, funcional y fisiológico, debido en última instancia a las dificultades en la expresión y purificación de esta clase de proteínas incrustadas en la membrana. Aquí, demostramos métodos para obtener cantidades de miligramos de alta pureza de proteínas transportadoras de SLC humanas utilizando secuencias de genes optimizadas para codones. Junto con una exploración sistemática del diseño de constructos y la expresión de alto rendimiento, estos protocolos garantizan la preservación de la integridad estructural y la actividad bioquímica de las proteínas diana. También destacamos los pasos críticos en la expresión de las células eucariotas, la purificación de la afinidad y la cromatografía de exclusión por tamaño de estas proteínas. En última instancia, este flujo de trabajo produce preparaciones de proteínas puras, funcionalmente activas y estables adecuadas para la determinación de estructuras de alta resolución, estudios de transporte, ensayos de compromiso de moléculas pequeñas y cribado in vitro de alto rendimiento.

Introduction

Las proteínas de membrana han sido durante mucho tiempo objetivos tanto para los investigadores como para las industrias farmacéuticas. De estos, los portadores de solutos (SLC) son una familia de más de 400 genes transportadores secundarios codificados dentro del genomahumano. Estos transportadores están involucrados en la importación y exportación de numerosas moléculas, incluidos iones2, neurotransmisores3, lípidos 4,5,6,7, aminoácidos8, nutrientes 9,10,11 y productos farmacéuticos 12. Con tal amplitud de sustratos, estas proteínas también están implicadas en una serie de fisiopatologías a través del transporte de toxinas13, el transporte y la inhibición por drogas de abuso 14,15 o mutaciones deletéreas16. Los homólogos bacterianos han servido como prototipos para el mecanismo de transporte fundamental de varias familias de SLC 17,18,19,20,21,22,23,24,25. A diferencia de las proteínas humanas, los ortólogos procariotas a menudo se expresan mejor en el bien conocido sistema de expresión de Escherichia coli 26,27 y son más estables en los detergentes más pequeños que producen cristales bien ordenados para la cristalografía de rayos X 28. Sin embargo, las diferencias de secuencia y funcionales complican el uso de estas proteínas lejanamente relacionadas para el descubrimiento de fármacos29,30. En consecuencia, a menudo se necesita un estudio directo de la proteína humana para descifrar el mecanismo de acción de los fármacos dirigidos a las SLC 31,32,33,34,35. Si bien los avances recientes en criomicroscopía electrónica (Cryo-EM) han permitido la caracterización estructural de las SLC en condiciones más nativas36,37, la dificultad para expresar y purificar estas proteínas sigue siendo un desafío para el desarrollo de terapias y diagnósticos dirigidos.

Para paliar este reto, el consorcio RESOLUTE (re-solute.eu) ha desarrollado recursos y protocolos para la expresión y purificación a gran escala de proteínas humanas de la familia SLC38. A partir de genes optimizados para codones, hemos desarrollado métodos para la clonación de alto rendimiento y el cribado de construcciones de SLC. Estos métodos se aplicaron sistemáticamente a toda la familia de SLC, los genes se clonaron en el sistema de expresión viral BacMam y la expresión de proteínas se probó en líneas celulares humanas39 sobre la base de métodos descritos anteriormente para la clonación de alto rendimiento y las pruebas de expresión40. En resumen, el gen SLC se clona a partir del plásmido pDONR221 en un vector pHTBV1.1. Esta construcción se utiliza posteriormente para transponer el gen de interés en un vector bacmid para la transfección de células de insectos, que incluye un promotor de citomegalovirus y elementos potenciadores para su expresión en células de mamíferos. El baculovirus resultante se puede utilizar para transducir células de mamíferos para la expresión de la proteína SLC diana.

Además, desarrollamos métodos estandarizados para la expresión a gran escala y la purificación estable de SLC seleccionadas (Figura 1). Este protocolo incluye varios puntos de control para facilitar la resolución eficaz de problemas y minimizar la variabilidad entre experimentos. En particular, el monitoreo rutinario de la expresión y localización de proteínas, así como la optimización a pequeña escala de las condiciones de purificación para objetivos individuales, se vieron ayudados por las etiquetas Strep y Green Fluorescent Protein (GFP)41,42.

En última instancia, estas muestras de proteínas químicamente puras y estructuralmente homogéneas se pueden utilizar para la determinación estructural mediante cristalografía de rayos X o criomicroscopía electrónica (Cryo-EM), ensayos bioquímicos de compromiso con dianas, inmunización para la generación de aglutinantes y estudios funcionales libres de células mediante la reconstitución en liposomas químicamente definidos.

Protocol

NOTA: Todos los genes RESOLUTE SLC optimizados para codones se han depositado en AddGene43, cuyos enlaces están disponibles en la lista de reactivos públicos RESOLUTE44. Estos genes se han clonado en el plásmido pDONR221 y permiten la clonación directa de los genes en el vector de destino mediante clonación por recombinación45. Para maximizar el paralelismo, las células bacterianas, de insectos y de mamíferos se cultivan en formato de bloque …

Representative Results

Los genes SLC se pueden clonar a partir de plásmidos pDONR RESOLUTE en vectores BacMam para la expresión en mamíferosLos protocolos descritos para la clonación, la expresión y la purificación han demostrado ser exitosos para muchos transportadores de SLC a través de múltiples pliegues de proteínas. Sin embargo, los procedimientos incluyen varios puntos de control para monitorear el progreso, lo que permite la optimización para tener en cuenta las diferencias en la expresión, el plegamiento…

Discussion

El desarrollo de terapias dirigidas al SLC se ha visto obstaculizado debido a la ausencia de una caracterización sistemática de la función transportadora. Esto ha llevado a un número desproporcionadamente menor de fármacos dirigidos a esta clase de proteínas en relación con los GPCR y los canales iónicos63, a pesar de sus numerosas funciones en los procesos normales y fisiopatológicos. RESOLUTE es un consorcio internacional destinado a desarrollar técnicas y herramientas de investigació…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo se realizó dentro del proyecto RESOLUTE. RESOLUTE ha recibido financiación de la Empresa Común para la Iniciativa sobre Medicamentos Innovadores 2 en virtud del acuerdo de subvención n.º 777372. Esta Empresa Común cuenta con el apoyo del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea y de la EFPIA. Este artículo refleja únicamente las opiniones de los autores y ni el IMI ni la Unión Europea y EFPIA son responsables del uso que pueda hacerse de la información contenida en el mismo. El plásmido pHTBV fue amablemente proporcionado por el Prof. Frederick Boyce (Harvard).

Materials

3C protease Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators Sartorius VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside Anatrace C325 CYMAL-5
96-well bacmid purification kit Millipore LSKP09604 Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL) Greiner Bio-One 780271
Adhesive plastic seals Qiagen 19570 Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse Produced in-house
BisTris Sigma Aldrich B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt Anatrace CH210 CHS
Cobalt metal affinity resin Takara Bio 635653 TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin Sigma Aldrich 851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column Cytiva 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin Apollo Scientific BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL) DWK Life Sciences 357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001 cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fos-Choline-12 Anatrace F308S FS-12
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Glyco-diosgenin Anatrace GDN101 GDN
Gravity flow columns Cole-Parmer WZ-06479-25
HEK293 medium Thermo Fisher 12338018 FreeStyle 293 medium
HEPES Apollo Scientific BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column Sepax 231300-4615 Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole Sigma Aldrich 56750
Insect transfection reagent Sigma Aldrich 71259 Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol Anatrace NG310 LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich M2670
Micro-expression shaker Glas-Col 107A DPMINC24CE
NaCl Sigma Aldrich S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside Anatrace D322 DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside Anatrace D310 DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide Anatrace D360 LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside Anatrace O311D OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		 Anatrace O330 C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol Anatrace NG311 OGNG
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537 DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether Anatrace AP1210 C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether Anatrace APO129 C12E9
Porous seal for tissue culture plates VWR 60941-084 Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Recombination enzyme mix Thermo Fisher 11791020 Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media Gibco 10902088 Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate Sigma Aldrich 303410
Sonicator 24-head probe Sonics 630-0579
Sonicator power unit Sonics VCX 750
Strep-Tactin resin IBA Life Sciences 2-5030-025 Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350 DDS
Suspension-adapted HEK293 cells Thermo Fisher A14527 Expi293F
Transfection reagent Sigma Aldrich 70967 GeneJuice Transfection Reagent
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Raturi, S., Li, H., Chang, Y., Scacioc, A., Bohstedt, T., Fernandez-Cid, A., Evans, A., Abrusci, P., Balakrishnan, A., Pascoa, T. C., He, D., Chi, G., Kaur Singh, N., Ye, M., Li, A., Shrestha, L., Wang, D., Williams, E. P., Burgess-Brown, N. A., Dürr, K. L., Puetter, V., Ingles-Prieto, A., Sauer, D. B. High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies. J. Vis. Exp. (199), e65878, doi:10.3791/65878 (2023).
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