JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생화학

Storskalig expression och rening av humana bärare av lösta ämnen för strukturella och biokemiska studier

Published: September 29, 2023
doi:
10.3791/65878
, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine,University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Summary

Strukturella och biokemiska studier av mänskliga membrantransportörer kräver milligram mängder av stabilt, intakt och homogent protein. Här beskriver vi skalbara metoder för att screena, uttrycka och rena mänskliga bärare av lösta ämnen med hjälp av kodonoptimerade gener.

Abstract

Solute bärare (SLC) är membrantransportörer som importerar och exporterar en rad endogena och exogena substrat, inklusive joner, näringsämnen, metaboliter, neurotransmittorer och läkemedel. Trots att denna grupp av proteiner har framstått som attraktiva terapeutiska mål och markörer för sjukdom är den fortfarande relativt underdrogad av dagens läkemedel. Läkemedelsutvecklingsprojekt för dessa transportörer hindras av begränsad strukturell, funktionell och fysiologisk kunskap, ytterst på grund av svårigheterna med att uttrycka och rena denna klass av membraninbäddade proteiner. Här demonstrerar vi metoder för att erhålla stora mängder av humana SLC-transportproteiner med hög renhet med hjälp av kodonoptimerade gensekvenser. I kombination med en systematisk utforskning av konstruktionsdesign och storskaligt uttryck säkerställer dessa protokoll bevarandet av målproteinernas strukturella integritet och biokemiska aktivitet. Vi belyser också kritiska steg i det eukaryota celluttrycket, affinitetsrening och storleksuteslutningskromatografi av dessa proteiner. I slutändan ger detta arbetsflöde rena, funktionellt aktiva och stabila proteinpreparat som är lämpliga för högupplöst strukturbestämning, transportstudier, analyser av småmolekylengagemang och in vitro-screening med hög genomströmning.

Introduction

Membranproteiner har länge varit måltavlor för både forskare och läkemedelsindustri. Av dessa är de lösta bärarna (SLC) en familj av över 400 sekundära transportgener som kodas i det mänskliga genomet1. Dessa transportörer är involverade i import och export av många molekyler, inklusive joner2, neurotransmittorer3, lipider 4,5,6,7, aminosyror 8, näringsämnen 9,10,11 och läkemedel 12. Med en sådan bredd av substrat är dessa proteiner också inblandade i en rad patofysiologier genom transport av toxiner13, transport av och hämning av missbruksdroger 14,15 eller skadliga mutationer16. Bakteriella homologer har fungerat som prototyper för den grundläggande transportmekanismen för flera SLC-familjer 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Till skillnad från mänskliga proteiner uttrycks prokaryota ortologer ofta bättre i det välförstådda Escherichia coli-uttryckssystemet 26,27 och är mer stabila i de mindre tvättmedlen som ger välordnade kristaller för röntgenkristallografi 28. Sekvens- och funktionsskillnader komplicerar dock användningen av dessa avlägset besläktade proteiner för läkemedelsutveckling29,30. Följaktligen behövs ofta direkta studier av det mänskliga proteinet för att dechiffrera verkningsmekanismen för läkemedel som riktar sig mot SLC 31,32,33,34,35. Även om de senaste framstegen inom kryoelektronmikroskopi (Cryo-EM) har möjliggjort strukturell karakterisering av SLC:er under mer nativa förhållanden36,37, är svårigheten att uttrycka och rena dessa proteiner fortfarande en utmaning för att utveckla riktade terapier och diagnostik.

För att mildra denna utmaning har Resolute-konsortiet (re-solute.eu) utvecklat resurser och protokoll för storskaligt uttryck och rening av humana proteiner i SLC-familjen38. Med utgångspunkt i kodonoptimerade gener har vi utvecklat metoder för storskalig kloning och screening av SLC-konstrukt. Dessa metoder tillämpades systematiskt på hela familjen av SLC, generna klonades in i BacMam-virusuttryckssystemet och proteinuttrycket testades i humana cellinjer39 baserat på tidigare beskrivna metoder för storskalig kloning och expressionstestning40. Sammanfattningsvis klonas SLC-genen från pDONR221-plasmiden till en pHTBV1.1-vektor. Denna konstruktion används sedan för att transponera genen av intresse till en bacmidvektor för transfektering av insektsceller, som inkluderar en cytomegaloviruspromotor och förstärkarelement för uttryck i däggdjursceller. Det resulterande baculoviruset kan användas för att transducera däggdjursceller för uttryck av målproteinet SLC.

Vi vidareutvecklade standardiserade metoder för storskalig expressionning och stabil rening av utvalda SLC:er (Figur 1). Det här protokollet innehåller flera kontrollpunkter för att underlätta effektiv felsökning och minimera variabiliteten mellan experiment. Rutinmässig övervakning av proteinuttryck och lokalisering, samt småskalig optimering av reningsförhållanden för enskilda mål, underlättades av Strep och Green Fluorescent Protein (GFP) taggar41,42.

I slutändan kan dessa kemiskt rena och strukturellt homogena proteinprover användas för strukturbestämning genom röntgenkristallografi eller kryoelektronmikroskopi (Cryo-EM), biokemiska målengagemangsanalyser, immunisering för bindemedelsgenerering och cellfria funktionella studier via rekonstituering till kemiskt definierade liposomer.

Protocol

OBS: Alla kodonoptimerade RESOLUTE SLC-gener har deponerats i AddGene43, vars länkar finns tillgängliga på listan över RESOLUTE offentliga reagenser44. Dessa gener har klonats in i pDONR221-plasmiden och möjliggör direkt kloning av generna till destinationsvektorn med hjälp av rekombinationskloning45. För att maximera parallelliteten odlas bakterie-, insekts- och däggdjursceller i blockformat för bakterieproduktion (avsnitt 3), baculovirusa…

Representative Results

SLC-gener kan klonas från RESOLUTE pDONR-plasmider till BacMam-vektorer för däggdjursuttryckDe beskrivna protokollen för kloning, uttryck och rening har visat sig vara framgångsrika för många SLC-transportörer över flera proteinveckningar. Icke desto mindre innehåller procedurerna flera kontrollpunkter för att övervaka framsteg, vilket möjliggör optimering för att ta hänsyn till skillnader i uttryck, proteinveckning, lipid- och detergentberoende stabilitet och känslighet för buffert…

Discussion

Utvecklingen av SLC-riktade terapier har förblivit hämmad på grund av frånvaron av systematisk karakterisering av transportörens funktion. Detta har lett till oproportionerligt färre läkemedel som riktar sig mot denna proteinklass jämfört med GPCR och jonkanaler63, trots deras många roller i normala och patofysiologiska processer. RESOLUTE är ett internationellt konsortium som syftar till att utveckla banbrytande forskningstekniker och verktyg för att påskynda och förbättra nuvarand…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete utfördes inom ramen för RESOLUTE-projektet. Resolute har fått finansiering från det gemensamma företaget för initiativet för innovativa läkemedel 2 enligt bidragsavtal nr 777372. Detta gemensamma företag får stöd från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 och EFPIA. Denna artikel återspeglar endast författarnas åsikter och varken IMI eller Europeiska unionen och EFPIA är ansvariga för hur informationen i artikeln används. PHTBV-plasmiden tillhandahölls vänligen av professor Frederick Boyce (Harvard).

Materials

3C protease Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators Sartorius VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside Anatrace C325 CYMAL-5
96-well bacmid purification kit Millipore LSKP09604 Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL) Greiner Bio-One 780271
Adhesive plastic seals Qiagen 19570 Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse Produced in-house
BisTris Sigma Aldrich B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt Anatrace CH210 CHS
Cobalt metal affinity resin Takara Bio 635653 TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin Sigma Aldrich 851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column Cytiva 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin Apollo Scientific BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL) DWK Life Sciences 357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001 cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fos-Choline-12 Anatrace F308S FS-12
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Glyco-diosgenin Anatrace GDN101 GDN
Gravity flow columns Cole-Parmer WZ-06479-25
HEK293 medium Thermo Fisher 12338018 FreeStyle 293 medium
HEPES Apollo Scientific BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column Sepax 231300-4615 Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole Sigma Aldrich 56750
Insect transfection reagent Sigma Aldrich 71259 Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol Anatrace NG310 LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich M2670
Micro-expression shaker Glas-Col 107A DPMINC24CE
NaCl Sigma Aldrich S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside Anatrace D322 DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside Anatrace D310 DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide Anatrace D360 LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside Anatrace O311D OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		 Anatrace O330 C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol Anatrace NG311 OGNG
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537 DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether Anatrace AP1210 C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether Anatrace APO129 C12E9
Porous seal for tissue culture plates VWR 60941-084 Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Recombination enzyme mix Thermo Fisher 11791020 Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media Gibco 10902088 Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate Sigma Aldrich 303410
Sonicator 24-head probe Sonics 630-0579
Sonicator power unit Sonics VCX 750
Strep-Tactin resin IBA Life Sciences 2-5030-025 Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350 DDS
Suspension-adapted HEK293 cells Thermo Fisher A14527 Expi293F
Transfection reagent Sigma Aldrich 70967 GeneJuice Transfection Reagent
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
  2. Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science. 335 (6069), 686-690 (2012).
  3. Bröer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters: the solute carrier family 6. British Journal of Pharmacology. 167 (2), 256-278 (2012).
  4. Anderson, C. M., Stahl, A. SLC27 fatty acid transport proteins. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2-3), 516-528 (2013).
  5. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  6. Kobayashi, N., et al. MFSD2B is a sphingosine 1-phosphate transporter in erythroid cells. Scientific Reports. 8 (1), 4969 (2018).
  7. Kawahara, A., et al. The sphingolipid transporter Spns2 functions in migration of zebrafish myocardial precursors. Science. 323 (5913), 524-527 (2009).
  8. Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
  9. Navale, A. M., Paranjape, A. N. Glucose transporters: physiological and pathological roles. Biophysical Reviews. 8 (1), 5-9 (2016).
  10. Pajor, A. M. Molecular properties of the SLC13 family of dicarboxylate and sulfate transporters. Pflügers Archiv – European Journal of Physiology. 451 (5), 597-605 (2006).
  11. Nwosu, Z. C., Song, M. G., Di Magliano, M. P., Lyssiotis, C. A., Kim, S. E. Nutrient transporters: connecting cancer metabolism to therapeutic opportunities. Oncogene. 42 (10), 711-724 (2023).
  12. Girardi, E., et al. A widespread role for SLC transmembrane transporters in resistance to cytotoxic drugs. Nature Chemical Biology. 16 (4), 469-478 (2020).
  13. Nigam, S. K. The SLC22 transporter family: a paradigm for the impact of drug transporters on metabolic pathways, signaling, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 663-687 (2018).
  14. Cheng, M. H., et al. Insights into the modulation of dopamine transporter function by amphetamine, orphenadrine, and cocaine binding. Frontiers in Neurology. 6, 134 (2015).
  15. Sachkova, A., Doetsch, D. A., Jensen, O., Brockmöller, J., Ansari, S. How do psychostimulants enter the human brain? Analysis of the role of the proton-organic cation antiporter. Biochemical Pharmacology. 192, 114751 (2021).
  16. Lin, L., Yee, S. W., Kim, R. B., Giacomini, K. M. SLC transporters as therapeutic targets: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (8), 543-560 (2015).
  17. Yernool, D., Boudker, O., Jin, Y., Gouaux, E. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii. Nature. 431 (7010), 811-818 (2004).
  18. Huang, Y., Lemieux, M. J., Song, J., Auer, M., Wang, D. -. N. Structure and mechanism of the glycerol-3-phosphate transporter from Escherichia coli. Science. 301 (5633), 616-620 (2003).
  19. Yamashita, A., Singh, S. K., Kawate, T., Jin, Y., Gouaux, E. Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl–dependent neurotransmitter transporters. Nature. 437 (7056), 215-223 (2005).
  20. Sauer, D. B., et al. Structural basis for the reaction cycle of DASS dicarboxylate transporters. eLife. 9, 61350 (2020).
  21. Levin, E. J., Quick, M., Zhou, M. Crystal structure of a bacterial homologue of the kidney urea transporter. Nature. 462 (7274), 757-761 (2009).
  22. Abramson, J., et al. Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Science. 301 (5633), 610-615 (2003).
  23. Faham, S., et al. The crystal structure of a sodium galactose transporter reveals mechanistic insights into Na + /sugar symport. Science. 321 (5890), 810-814 (2008).
  24. Lopez-Redondo, M. L., Coudray, N., Zhang, Z., Alexopoulos, J., Stokes, D. L. Structural basis for the alternating access mechanism of the cation diffusion facilitator YiiP. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (12), 3042-3047 (2018).
  25. Mulligan, C., et al. The bacterial dicarboxylate transporter VcINDY uses a two-domain elevator-type mechanism. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (3), 256-263 (2016).
  26. Kermani, A. A. A guide to membrane protein X-ray crystallography. The FEBS Journal. 288 (20), 5788-5804 (2021).
  27. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  28. Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
  29. Wang, H., et al. Structural basis for action by diverse antidepressants on biogenic amine transporters. Nature. 503 (7474), 141-145 (2013).
  30. Malinauskaite, L., et al. A mechanism for intracellular release of Na+ by neurotransmitter/sodium symporters. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (11), 1006-1012 (2014).
  31. Sauer, D. B., et al. Structure and inhibition mechanism of the human citrate transporter NaCT. Nature. 591 (7848), 157-161 (2021).
  32. Qiu, B., Matthies, D., Fortea, E., Yu, Z., Boudker, O. Cryo-EM structures of excitatory amino acid transporter 3 visualize coupled substrate, sodium, and proton binding and transport. Science Advances. 7 (10), eabf5814 (2021).
  33. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  34. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. 532 (7599), 334-339 (2016).
  35. Han, L., et al. Structure and mechanism of the SGLT family of glucose transporters. Nature. 601 (7892), 274-279 (2022).
  36. Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1863 (3), 183533 (2021).
  37. Piper, S. J., Johnson, R. M., Wootten, D., Sexton, P. M. Membranes under the magnetic lens: a dive into the diverse world of membrane protein structures using Cryo-EM. Chemical Reviews. 122 (17), 13989-14017 (2022).
  38. Superti-Furga, G., et al. The RESOLUTE consortium: unlocking SLC transporters for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (7), 429-430 (2020).
  39. Fornwald, J. A., Lu, Q., Boyce, F. M., Ames, R. S. Gene expression in mammalian cells using BacMam, a modified baculovirus system. Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols. 1350, 95-116 (2016).
  40. Mahajan, P., et al. Expression screening of human integral membrane proteins using BacMam. Structural Genomics. 2199, 95-115 (2021).
  41. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  42. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  43. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307 (5717), 1877-1877 (2005).
  44. . Resolute Public Reagents Available from: https://re-solute.eu/resources/reagents (2023)
  45. Hartley, J. L. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  46. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  47. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).
  48. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  49. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the Plaque Technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
  50. Hitchman, R. B., Siaterli, E. A., Nixon, C. P., King, L. A. Quantitative real-time PCR for rapid and accurate titration of recombinant baculovirus particles. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 810-814 (2007).
  51. Hopkins, R. F., Esposito, D. A rapid method for titrating baculovirus stocks using the Sf-9 Easy Titer cell line. BioTechniques. 47 (3), 785-788 (2009).
  52. Shen, C. F., Meghrous, J., Kamen, A. Quantitation of baculovirus particles by flow cytometry. Journal of Virological Methods. 105 (2), 321-330 (2002).
  53. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Seshagiri, S. Estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Nature Protocols. 1 (5), 2271-2276 (2006).
  54. Bird, L. E., et al. fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments. (95), 52357 (2015).
  55. Biedermann, K., Jepsen, P. K., Riise, E., Svendsen, I. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia coli. Carlsberg Research Communications. 54 (1), 17-27 (1989).
  56. Cong, Q., Grishin, N. V. MESSA: MEta-Server for protein Sequence Analysis. BMC Biology. 10 (1), 82 (2012).
  57. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  58. Baek, M., et al. Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network. Science. 373 (6557), 871-876 (2021).
  59. Mancusso, R., Karpowich, N. K., Czyzewski, B. K., Wang, D. -. N. Simple screening method for improving membrane protein thermostability. Methods. 55 (4), 324-329 (2011).
  60. Majd, H., et al. Screening of candidate substrates and coupling ions of transporters by thermostability shift assays. eLife. 7, e38821 (2018).
  61. Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).
  62. Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
  63. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  64. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  65. Kaipa, J. M., Krasnoselska, G., Owens, R. J., Van Den Heuvel, J. Screening of membrane protein production by comparison of transient expression in insect and mammalian cells. Biomolecules. 13 (5), 817 (2023).
  66. Khanppnavar, B., et al. Structural basis of organic cation transporter-3 inhibition. Nature Communications. 13 (1), 6714 (2022).
  67. Marheineke, K., Grünewald, S., Christie, W., Reiländer, H. Lipid composition of Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichoplusia ni (Tn) insect cells used for baculovirus infection. FEBS Letters. 441 (1), 49-52 (1998).
  68. Majeed, S., Ahmad, A. B., Sehar, U., Georgieva, E. R. Lipid membrane mimetics in functional and structural studies of integral membrane proteins. Membranes. 11 (9), 685 (2021).
  69. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. 생화학. 56 (30), 3962-3971 (2017).
  70. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, e34317 (2018).
  71. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab on a Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  72. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-based electrophysiology for transporter research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  73. Maynard, J. A., et al. Surface plasmon resonance for high-throughput ligand screening of membrane-bound proteins. Biotechnology Journal. 4 (11), 1542-1558 (2009).
  74. Haffke, M., Duckely, M., Bergsdorf, C., Jaakola, V. -. P., Shrestha, B. Development of a biochemical and biophysical suite for integral membrane protein targets: A review. Protein Expression and Purification. 167, 105545 (2020).

Tags

Solute CarriersSLCsMembrane TransportersDrug DiscoveryHigh-throughput ExpressionProtein PurificationStructural StudiesBiochemical StudiesReSOLUTEBacMam Expression SystemCryo-EM
check_url/kr/65878?article_type=t&slug=high-throughput-expression-purification-human-solute-carriers-for

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Raturi, S., Li, H., Chang, Y., Scacioc, A., Bohstedt, T., Fernandez-Cid, A., Evans, A., Abrusci, P., Balakrishnan, A., Pascoa, T. C., He, D., Chi, G., Kaur Singh, N., Ye, M., Li, A., Shrestha, L., Wang, D., Williams, E. P., Burgess-Brown, N. A., Dürr, K. L., Puetter, V., Ingles-Prieto, A., Sauer, D. B. High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies. J. Vis. Exp. (199), e65878, doi:10.3791/65878 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image