تقييم العمارة الدقيقة للعظام التربيقية في نموذج فأر هشاشة العظام
Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة اقتصادية وفعالة للتقييم الكمي للهندسة المعمارية الدقيقة للعظام في نموذج فأر لهشاشة العظام من خلال الجمع بين تلطيخ الهيماتوكسيلين-إيوسين (HE) وتقنيات التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (Micro-CT).
Abstract
تشير البنية المجهرية للعظام إلى ترتيب وجودة أنسجة العظام على المستوى المجهري. يعد فهم البنية المجهرية للعظام للهيكل العظمي أمرا بالغ الأهمية لاكتساب نظرة ثاقبة للفيزيولوجيا المرضية لهشاشة العظام وتحسين علاجها. ومع ذلك ، يمكن أن يكون التعامل مع عينات العظام معقدا بسبب خصائصها الصلبة والكثيفة. ثانيا ، تجعل البرامج المتخصصة معالجة الصور وتحليلها أمرا صعبا. في هذا البروتوكول ، نقدم حلا فعالا من حيث التكلفة وسهل الاستخدام لتحليل البنية المجهرية للعظام التربيقية . يتم توفير خطوات واحتياطات مفصلة. Micro-CT هي تقنية تصوير ثلاثية الأبعاد (3D) غير مدمرة توفر صورا عالية الدقة لبنية العظام التربيقية . يسمح بالتقييم الموضوعي والكمي لجودة العظام ، وهذا هو السبب في أنه ينظر إليه على نطاق واسع على أنه الطريقة القياسية الذهبية لتقييم جودة العظام. ومع ذلك ، لا يزال قياس الشكل النسيجي لا غنى عنه لأنه يوفر معلمات حاسمة على المستوى الخلوي ، مما يسد الفجوة بين التقييمات ثنائية الأبعاد (2D) و 3D لعينات العظام. أما بالنسبة للتقنيات النسيجية ، فقد اخترنا إزالة الكلس من أنسجة العظام ثم إجراء تضمين البارافين التقليدي. باختصار ، يمكن أن يوفر الجمع بين هاتين الطريقتين معلومات أكثر شمولا ودقة عن البنية المجهرية للعظام.
Introduction
هشاشة العظام هي مرض عظمي استقلابي منتشر ، خاصة بين كبار السن ، ويرتبط بزيادة خطر الإصابة بكسور الهشاشة. نظرا لأن هشاشة العظام أصبحت أكثر شيوعا في الصين1 ، سيكون هناك طلب متزايد على دراسة الهياكل العظمية للحيوانات الصغيرة 2,3. تعتمد الطرق السابقة لقياس فقدان العظام على نتائج قياس امتصاص الأشعة السينية ثنائي الطاقة ثنائي الأبعاد. ومع ذلك ، فإن هذا لا يلتقط التغيرات في البنية المجهرية المعمارية للعظم التربيقي ، وهو عامل رئيسي لقوة الهيكل العظمي4. تؤثر البنية المجهرية للعظام على قوتها وصلابتها ومقاومتها للكسر. من خلال مقارنة العمارة الدقيقة للعظام في الحالات الطبيعية والمرضية ، يمكن تحديد التغيرات في مورفولوجيا أنسجة العظام وهيكلها ووظيفتها الناتجة عن هشاشة العظام. تساهم هذه المعلومات في فهم تطور مرض هشاشة العظام وارتباطه بأمراض أخرى.
أصبح التصوير المقطعي المحوسب الدقيق (Micro-CT) مؤخرا تقنية شائعة لتقييم مورفولوجيا العظام ، حيث يمكن أن يوفر بيانات دقيقة وشاملة عن بنية العظام ومعلمات الكثافة مثل جزء حجم العظام وسمكها وفصلها 5,6. في الوقت نفسه ، يمكن أن تتأثر نتائج Micro-CT ببرنامج التحليل7. يتم استخدام طرق مختلفة للحصول على الصور وتقييمها وإعداد التقارير من قبل العديد من أنظمة التصوير المقطعي المحوسب التجارية الدقيقة. هذا التناقض يجعل من الصعب مقارنة وتفسير النتائج التي أبلغت عنها الدراسات المختلفة5. أيضا ، لا يمكن أن يحل حاليا محل قياس الأنسجة العظمية في تزويد الباحثين بمعلومات حول المعلمات على المستوى الخلوي في نظام الهيكل العظمي8. وفي الوقت نفسه ، تسمح التقنيات النسيجية بالملاحظة المباشرة وقياس التشكل المجهري للعظام. تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (HE) هو تقنية تلطيخ شائعة تستخدم في علم الأنسجة لتصور البنية العامة للخلايا والأنسجة. يتم استخدامه لتحديد وجود أنسجة العظام وبنيتها الدقيقة.
تستخدم هذه المقالة Micro-CT جنبا إلى جنب مع تقنية تقطيع الأنسجة (تلطيخ الهيماتوكسيلين-Eosin [HE]) لجمع صور أنسجة العظام وإجراء تحليل كمي للعظم التربيقي لتقييم التغيرات في البنية المجهرية للعظام في نموذج فأر هشاشة العظام.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن تؤدي هشاشة العظام إلى كسور متكررة ، وهي مكلفة ، ويمكن أن تسبب الألم أو الإعاقة أو حتى الموت ، وتؤثر بشكل خطير على نوعية حياة المرضى20. على مر السنين ، تم التعرف على نموذج استئصال المبيض كأحد الطرق القياسية لدراسة هشاشة العظام21. النموذج الحيواني قبل السريري ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل إدارة مقاطعة سيتشوان للطب الصيني التقليدي (2021YJ0175) ومشروع ابتكار أبحاث الدراسات العليا لكلية الطب السريري (LCYJSKT2023-11) ، جامعة تشنغدو للطب الصيني التقليدي.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Analyze 12.0 | AnalyzeDirect, Inc | ||
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T. Animal models for osteoporosis. European Journal of Pharmacology. 759, 287-294 (2015).
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M. BoneJ2-refactoring established research software. Wellcome Open Research. 6, 37 (2021).
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women’s Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
