Avaliação da Microarquitetura Óssea Trabecular em Modelo de Osteoporose em Camundongos
Summary
Este protocolo apresenta um método econômico e eficiente para avaliação quantitativa da microarquitetura óssea em um modelo de osteoporose em camundongos, combinando técnicas de coloração pela hematoxilina-eosina (HE) e microtomografia computadorizada (Micro-CT).
Abstract
A microestrutura óssea refere-se à disposição e qualidade do tecido ósseo em nível microscópico. A compreensão da microestrutura óssea do esqueleto é crucial para obter informações sobre a fisiopatologia da osteoporose e melhorar seu tratamento. No entanto, o manuseio de amostras ósseas pode ser complexo devido às suas propriedades duras e densas. Em segundo lugar, softwares especializados dificultam o processamento e a análise de imagens. Neste protocolo, apresentamos uma solução econômica e de fácil utilização para análise da microestrutura óssea trabecular. Etapas detalhadas e precauções são fornecidas. A micro-TC é uma técnica de imagem tridimensional (3D) não destrutiva que fornece imagens de alta resolução da estrutura óssea trabecular. Permite a avaliação objetiva e quantitativa da qualidade óssea, razão pela qual é amplamente considerado como o método padrão-ouro para avaliação da qualidade óssea. No entanto, a histomorfometria permanece indispensável, pois oferece parâmetros cruciais em nível celular, preenchendo a lacuna entre avaliações bidimensionais (2D) e 3D de espécimes ósseos. Quanto às técnicas histológicas, optou-se pela descalcificação do tecido ósseo e, em seguida, realizar a tradicional inclusão em parafina. Em resumo, a combinação desses dois métodos pode fornecer informações mais abrangentes e precisas sobre a microestrutura óssea.
Introduction
A osteoporose é uma doença óssea metabólica prevalente, especialmente entre os idosos, e está associada a um risco aumentado de fraturas por fragilidade. À medida que a osteoporose se torna mais comum na China1, haverá uma demanda crescente para o estudo das estruturas ósseas de pequenos animais 2,3. Os métodos anteriores de mensuração da perda óssea baseiam-se nos resultados da absorciometria bidimensional de raios-X de dupla energia. No entanto, isso não capta as alterações na microestrutura arquitetural do osso trabecular, que é um fator-chave para a resistênciaesquelética4. A microestrutura do osso afeta sua resistência, rigidez e resistência à fratura. Comparando-se a microarquitetura óssea nos estados normal e patológico, é possível identificar alterações na morfologia, estrutura e função do tecido ósseo causadas pela osteoporose. Essas informações contribuem para o entendimento do desenvolvimento da osteoporose e sua associação com outras doenças.
A microtomografia computadorizada (Micro-CT) tornou-se recentemente uma técnica popular para avaliação da morfologia óssea, onde pode fornecer dados precisos e abrangentes sobre parâmetros de estrutura e densidade óssea, como volume, fração, espessura e separaçãoóssea5,6. Ao mesmo tempo, os resultados do Micro-CT podem ser afetados pelo software de análise7. Diferentes métodos de aquisição, avaliação e emissão de laudos de imagens são utilizados por vários sistemas comerciais de Micro-CT. Essa inconsistência dificulta a comparação e interpretação dos resultados relatados por diferentes estudos5. Além disso, atualmente não pode substituir a histomorfometria óssea no fornecimento de informações aos pesquisadores sobre parâmetros em nível celular no sistema esquelético8. Enquanto isso, as técnicas histológicas permitem a observação direta e a mensuração da morfologia microscópica do osso. A coloração pela hematoxilina e eosina (HE) é uma técnica de coloração comum usada em histologia para visualizar a estrutura geral de células e tecidos. É utilizado para identificar a presença de tecido ósseo e sua microarquitetura.
Este artigo utiliza a Micro-CT combinada com a técnica de fatiamento tecidual (coloração Hematoxilina-Eosina [HE]) para coletar imagens do tecido ósseo e realizar análise quantitativa do osso trabecular para avaliar as alterações da microestrutura óssea em um modelo de camundongo com osteoporose.
Protocol
Representative Results
Discussion
A osteoporose pode levar a fraturas frequentes, que são dispendiosas, podem causar dor, incapacidade ou até mesmo a morte, e afetar seriamente a qualidade de vida dos pacientes20. Ao longo dos anos, o modelo de ooforectomia tem sido reconhecido como um dos métodos padrão para o estudo da osteoporose21. O modelo animal pré-clínico mais comum para osteoporose é o rato ovariectomizado (OVX). Apesar disso, a maioria das pesquisas sobre os mecanismos das desordens ósseas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Administração Provincial de Sichuan de Medicina Tradicional Chinesa (2021YJ0175) e pelo Projeto de Inovação de Pesquisa de Pós-Graduação da Escola de Medicina Clínica (LCYJSKT2023-11), Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Analyze 12.0 | AnalyzeDirect, Inc | ||
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
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