Utvärdering av trabekulär benmikroarkitektur i en osteoporosmusmodell
Summary
Detta protokoll presenterar en ekonomisk och effektiv metod för kvantitativ utvärdering av benmikroarkitektur i en musmodell av osteoporos genom att kombinera hematoxylin-eosin (HE) färgning och mikrodatortomografi (Micro-CT) tekniker.
Abstract
Benmikrostruktur avser benvävnadens arrangemang och kvalitet på mikroskopisk nivå. Att förstå skelettets benmikrostruktur är avgörande för att få insikt i patofysiologin vid osteoporos och förbättra dess behandling. Att hantera benprover kan dock vara komplicerat på grund av deras hårda och täta egenskaper. För det andra gör specialiserad programvara bildbehandling och analys svår. I detta protokoll presenterar vi en kostnadseffektiv och lättanvänd lösning för analys av trabekulär benmikrostruktur. Detaljerade steg och försiktighetsåtgärder tillhandahålls. Micro-CT är en icke-destruktiv tredimensionell (3D) avbildningsteknik som ger högupplösta bilder av trabekulär benstruktur. Det möjliggör objektiv och kvantitativ utvärdering av benkvalitet, vilket är anledningen till att det allmänt betraktas som guldstandardmetoden för bedömning av benkvalitet. Hitomorfometri är dock fortfarande oumbärlig eftersom den erbjuder viktiga parametrar på cellnivå, vilket överbryggar klyftan mellan tvådimensionella (2D) och 3D-bedömningar av benprover. När det gäller de histologiska teknikerna valde vi att avkalka benvävnaden och sedan utföra traditionell paraffininbäddning. Sammanfattningsvis kan en kombination av dessa två metoder ge mer omfattande och exakt information om benets mikrostruktur.
Introduction
Osteoporos är en utbredd metabolisk bensjukdom, särskilt bland äldre, och är förknippad med en ökad risk för skörhetsfrakturer. I takt med att osteoporos blir vanligare i Kina1 kommer det att finnas en växande efterfrågan på att studera benstrukturerna hos smådjur 2,3. De tidigare metoderna för att mäta benförlust bygger på resultaten av tvådimensionell dubbelenergiröntgenabsorptiometri. Detta fångar dock inte förändringarna i det trabekulära benets arkitektoniska mikrostruktur, som är en nyckelfaktor för skelettets styrka4. Benets mikrostruktur påverkar dess styrka, styvhet och brottmotstånd. Genom att jämföra benets mikroarkitektur i normala och patologiska tillstånd kan förändringar i benvävnadens morfologi, struktur och funktion orsakade av osteoporos identifieras. Denna information bidrar till förståelsen av utvecklingen av osteoporos och dess samband med andra sjukdomar.
Mikrodatortomografi (Micro-CT) har nyligen blivit en populär teknik för bedömning av benmorfologi, där den kan ge exakta och omfattande data om benstruktur och densitetsparametrar såsom benvolymfraktion, tjocklek och separation 5,6. Samtidigt kan Micro-CT-resultaten påverkas av analysprogramvaran7. Olika metoder för bildinsamling, utvärdering och rapportering används av olika kommersiella Micro-CT-system. Denna inkonsekvens gör det svårt att jämföra och tolka de resultat som rapporteras av olika studier5. Dessutom kan den för närvarande inte ersätta benhistomorfhometri när det gäller att förse forskare med information om parametrar på cellnivå i skelettsystemet8. Samtidigt möjliggör histologiska tekniker direkt observation och mätning av benets mikroskopiska morfologi. Hematoxylin och eosin (HE) färgning är en vanlig färgningsteknik som används inom histologi för att visualisera den allmänna strukturen hos celler och vävnader. Det används för att identifiera förekomsten av benvävnad och dess mikroarkitektur.
Denna artikel använder Micro-CT i kombination med vävnadsskivningsteknik (Hematoxylin-Eosin [HE] färgning) för att samla in benvävnadsbilder och utföra kvantitativ analys av trabekulärt ben för att utvärdera förändringarna i benmikrostrukturen i en osteoporosmusmodell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoporos kan leda till frekventa frakturer, som är kostsamma, kan orsaka smärta, funktionshinder eller till och med dödsfall och allvarligtpåverka patienternas livskvalitet. Under årens lopp har ovariektomimodellen erkänts som en av standardmetoderna för att studera osteoporos21. Den vanligaste prekliniska djurmodellen för osteoporos är ovariektomerad (OVX) råtta. Trots detta har majoriteten av forskningen om mekanismerna för bensjukdomar, inklusive benskörhet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Sichuan Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine (2021YJ0175) och Graduate Research Innovation Project vid School of Clinical Medicine (LCYJSKT2023-11), Chengdu University of Traditional Chinese Medicine.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | ||
| Ammonia Solution | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2021070101 | |
| Analyze 12.0 | AnalyzeDirect, Inc | ||
| Anatomical Forceps | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J3C030 | |
| Anhydrous Ethanol | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022070501 | |
| Automatic Dyeing Machine | Thermo scientific | Varistain™ Gemini ES | |
| Bone Microarchitecture Analysis Add-on | AnalyzeDirect, Inc | ||
| C57BL/6J mice | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Carrier Slides | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd | 220518001 | |
| Coverslips | Nantong Mei Wei De Experimental Equipment Co. | 220518001 | |
| Decalcification Solution | Wuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd | CR2203047 | |
| Delicate Scissors | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | ZJA010 | |
| Embedding box marking machine | Thermo scientific | PrintMate AS | |
| Embedding Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | |
| Fiji: ImageJ | National Institutes of Health, USA | ||
| Film Sealer | Thermo scientific | Autostainer 360 | |
| Freezing Table | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| H&E Staining Kit | Leagene | DH0020 | |
| Hydrochloric Acid Solution | Sichuan Xilong Science Co., Ltd | 210608 | |
| ImageJ2 Plugin | BoneJ 7.0.16 | ||
| Medical Gauze | Shandong Ang Yang Medical Technology Co. | ||
| Mersilk 3-0 Silk Braided Non-Absorbable Sutures | Ethicon, Inc. | SA84G | |
| Needle Holder | Jinzhong surgical instrument Co., Ltd | J32010 | |
| Neutral Balsam | Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd | 10004160 | |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | |
| PANNORAMIC Digital Slide Scanners | 3DHISTECH Ltd. | PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | |
| PBS buffer | Biosharp | G4202 | |
| Povidone-iodine solution 5% | Chengdu Yongan Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Quantum GX2 microCT Imaging System | PerkinElmer, Inc. | ||
| Rotary Microtome | Thermo scientific | HM325 | |
| Scalpel | Quanzhou Excellence Medical Co., Ltd | 20170022 | |
| Scan & Browse Software | 3DHISTECH Ltd. | CaseViewer2.4 | |
| Single-Use Sterile Rubber Surgical Gloves | Guangdong Huitong Latex Products Group Co., Ltd | 22B141EO | |
| Sodium Chloride Solution 0.9% | Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd | ||
| Sterile Hypodermic Syringes for Single Use | Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd | ||
| Sterile Medical Suture Needles | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd. | PW8068 | |
| Tissue Processor | Thermo scientific | STP420 ES | |
| Tissue Spreading and Baking Machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JK-6 | |
| Tribromoethanol | Nanjing Aibei Biotechnology Co., Ltd | M2920 | |
| Wax Trimmer | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JXL-818 | |
| Xylene | Chengdu Kolon Chemical Co., Ltd | 2022051901 |
References
- Wang, J., et al. The prevalence of osteoporosis in China, a community based cohort study of osteoporosis. Frontiers in Public Health. 11, 1084005 (2023).
- Stein, M., et al. Why animal experiments are still indispensable in bone research: A statement by the European Calcified Tissue Society. Journal of Bone and Mineral Research. 38 (8), 1045-1061 (2023).
- Kerschan-Schindl, K., Papageorgiou, M., Föger-Samwald, U., Butylina, M., Weber, M., Pietschmann, P. Assessment of bone microstructure by micro CT in C57BL/6J mice for sex-specific differentiation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 14585 (2022).
- Fonseca, H., Moreira-Gonçalves, D., Coriolano, H. J. A., Duarte, J. A. Bone quality: the determinants of bone strength and fragility. Sports Medicine. 44, 37-53 (2014).
- Bouxsein, M. L., Boyd, S. K., Christiansen, B. A., Guldberg, R. E., Jepsen, K. J., Müller, R. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Akhter, M. P., Recker, R. R. High resolution imaging in bone tissue research-review. Bone. 143, 115620 (2021).
- Mys, K., et al. Quantification of 3D microstructural parameters of trabecular bone is affected by the analysis software. Bone. 142, 115653 (2021).
- Chavassieux, P., Chapurlat, R. Interest of bone histomorphometry in bone pathophysiology investigation: Foundation, present, and future. Frontiers in Endocrinology. 13, 907914 (2022).
- Komori, T. Animal models for osteoporosis. European Journal of Pharmacology. 759, 287-294 (2015).
- Zhu, S., et al. Ovariectomy-induced bone loss in TNFα and IL6 gene knockout mice is regulated by different mechanisms. Journal of Molecular Endocrinology. 60 (3), 185-198 (2018).
- Baum, T., et al. Osteoporosis imaging: effects of bone preservation on MDCT-based trabecular bone microstructure parameters and finite element models. BMC Medical Imaging. 15, 22 (2015).
- Nazarian, A., Hermannsson, B. J., Muller, J., Zurakowski, D., Snyder, B. D. Effects of tissue preservation on murine bone mechanical properties. Journal of Biomechanics. 42 (1), 82-86 (2009).
- Martín-Badosa, E., Amblard, D., Nuzzo, S., Elmoutaouakkil, A., Vico, L., Peyrin, F. Excised bone structures in mice: imaging at three-dimensional synchrotron radiation micro CT. Radiology. 229 (3), 921-928 (2003).
- Egan, K. P., Brennan, T. A., Pignolo, R. J. Bone histomorphometry using free and commonly available software. Histopathology. 61 (6), 1168-1173 (2012).
- Brandi, M. L. Microarchitecture, the key to bone quality. Rheumatology. 48 (suppl_4), iv3-iv8 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Domander, R., Felder, A. A., Doube, M. BoneJ2-refactoring established research software. Wellcome Open Research. 6, 37 (2021).
- Parfitt, A. M., et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units: report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee. Journal of Bone and Mineral Research. 2 (6), 595-610 (1987).
- Kazama, J. J., Koda, R., Yamamoto, S., Narita, I., Gejyo, F., Tokumoto, A. Cancellous bone volume is an indicator for trabecular bone connectivity in dialysis patients. Clinical Journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 5 (2), 292-298 (2010).
- Watts, N. B. Postmenopausal osteoporosis: A clinical review. Journal of Women’s Health. 27 (9), 1093-1096 (2018).
- Thompson, D. D., Simmons, H. A., Pirie, C. M., Ke, H. Z. FDA Guidelines and animal models for osteoporosis. Bone. 17 (4), S125-S133 (1995).
- Iwaniec, U. T., Yuan, D., Power, R. A., Wronski, T. J. Strain-dependent variations in the response of cancellous bone to ovariectomy in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 21 (7), 1068-1074 (2006).
- Ferguson, V. L., Ayers, R. A., Bateman, T. A., Simske, S. J. Bone development and age-related bone loss in male C57BL/6J mice. Bone. 33 (3), 387-398 (2003).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (8), 1197-1207 (2007).
- Seeman, E. The structural and biomechanical basis of the gain and loss of bone strength in women and men. Endocrinology and Metabolism Clinics. 32 (1), 25-38 (2003).
- Ticha, P., et al. A novel cryo-embedding method for in-depth analysis of craniofacial mini pig bone specimens. Scientific Reports. 10 (1), 19510 (2020).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology. 47 (suppl_4), iv9-iv16 (2008).
- Zaw Thin, M., Moore, C., Snoeks, T., Kalber, T., Downward, J., Behrens, A. Micro-CT acquisition and image processing to track and characterize pulmonary nodules in mice. Nature Protocols. 18 (3), 990-1015 (2023).
