Efficiënte generatie van muizen chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen
Summary
Dit protocol stroomlijnt de productie van retrovirale vectoren en de transductie van T-cellen bij muizen, waardoor de efficiënte generatie van CAR-T-cellen van muizen wordt vergemakkelijkt.
Abstract
Gemanipuleerde celtherapieën die gebruik maken van chimere antigeenreceptor (CAR)-T-cellen hebben een opmerkelijke effectiviteit bereikt bij personen met hematologische maligniteiten en worden momenteel ontwikkeld voor de behandeling van diverse solide tumoren. Tot nu toe heeft de voorlopige evaluatie van nieuwe CAR-T-celproducten voornamelijk plaatsgevonden in xenotransplantaattumormodellen met behulp van immunodeficiënte muizen. Deze aanpak is gekozen om de succesvolle implantatie van menselijke CAR-T-cellen in de experimentele setting te vergemakkelijken. Syngene muismodellen, waarin tumoren en CAR-T-cellen zijn afgeleid van dezelfde muizenstam, maken het echter mogelijk om nieuwe CAR-technologieën te evalueren in de context van een functioneel immuunsysteem en een uitgebreide tumormicro-omgeving (TME). Het hier beschreven protocol heeft tot doel het proces van het genereren van CAR-T-cellen in muizen te stroomlijnen door gestandaardiseerde methoden voor retrovirale transductie en ex vivo T-celkweek te presenteren. De methoden die in dit protocol worden beschreven, kunnen worden toegepast op andere CAR-constructies dan die welke in deze studie zijn gebruikt om routinematige evaluatie van nieuwe CAR-technologieën in immuuncompetente systemen mogelijk te maken.
Introduction
Adoptieve T-celtherapieën die chimere antigeenreceptoren (CAR’s) tot expressie brengen, hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van kankerimmunotherapie door gebruik te maken van de kracht van het adaptieve immuunsysteem om specifiek antigeen-positieve kankercellen aan te pakken en te elimineren1. Hoewel het succes van CAR-T-celtherapieën gericht op B-celmaligniteiten klinisch is gevalideerd, blijven preklinische studies uitgevoerd in diermodellen van vitaal belang voor de ontwikkeling van nieuwe CAR’s gericht op solide tumoren. Tot nu toe is echter een beperkte klinische werkzaamheid aangetoond bij solide tumorindicaties, en het wordt steeds duidelijker dat individuele preklinische modellen de farmacodynamiek en klinische werkzaamheid van een levend geneesmiddel niet nauwkeurig voorspellen 2,3. Daarom zijn onderzoekers begonnen met het uitbreiden van de preklinische studie van CAR-T-celproducten met parallelle beoordelingen in xenotransplantaat- en syngene modellen van respectievelijk menselijke en muizenkankers.
In tegenstelling tot xenotransplantaatmodellen, waarbij menselijke tumoren en T-cellen worden geënt in immunodeficiënte muizen, maken syngene modellen het mogelijk om CAR-T-celresponsen te onderzoeken in de context van een functioneel immuunsysteem. In het bijzonder bieden immuuncompetente muizen met syngene tumoren een systeem om de interactie tussen adoptief overgebrachte T-cellen en contextspecifieke milieus te bestuderen – waaronder tumor-geassocieerde macrofagen (TAM’s) en regulerende T-cellen (Tregs) waarvan bekend is dat ze de T-celfunctie in de tumormicro-omgeving (TME) onderdrukken4,5,6. Bovendien bieden syngene modellen een extra platform om on-target, off-tumor toxiciteit en CAR-T-celinteractie met gastheerfactoren te beoordelen die kunnen leiden tot extra toxiciteiten, waaronder cytokine release syndrome7.
Ondanks deze voordelen blijft het aantal syngene CAR-T-celstudies beperkt. Syngene modellen vereisen met name autologe engineering van CAR-T-cellen van dezelfde muizenstam en vormen dus een extra uitdaging vanwege het gebrek aan methodologie voor efficiënte muizen-T-celtransductie en ex vivo-expansie 2,8. Dit protocol schetst de methoden om stabiele CAR-expressie te bereiken door de productie van retrovirale vectoren en geoptimaliseerde T-celtransductie. Een schema van het gehele proces is weergegeven in figuur 1. Het gebruik van deze aanpak toont een efficiënte retrovirale transductie van muizen CAR-T-cellen en het bereiken van een hoge CAR-expressie zonder de noodzaak van virale concentratie door middel van ultracentrifugatie. Strategieën om de antigeenspecificiteit van het CAR-construct te veranderen worden besproken naast de co-expressie van bijkomende transgenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de stappen en reagentia die nodig zijn voor de retrovirale transductie van muizen-T-cellen om CAR-T-cellen te genereren voor in vivo studies. Door de retrovirale transductieomstandigheden te optimaliseren, wordt een robuuste CAR-expressie bereikt zonder dat virale concentratie nodig is door middel van ultracentrifugatie of extra reagentia. Er zijn echter meerdere wijzigingen die op deze methodologie kunnen worden toegepast.
Hoewel dit protocol het voorbeeld bes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken L. Brockmann voor zijn kritische beoordeling van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH 1R01EB030352 en UL1 TR001873.
Materials
| 0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS buffer | BD | BDB554657 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
| Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
| Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
| Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
| Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
| RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
References
- June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
- Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
- Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
- Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).
- Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
- Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
- Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
- Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).
- Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
- Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299 (2021).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , (2023).
- Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
- Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
- Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
- Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
- Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702 (2020).
- Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
- Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
- Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).
- Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).
