Effektiv generering av Murine kimær antigenreseptor (CAR)-T-celler
Summary
Denne protokollen strømlinjeformer retroviral vektorproduksjon og murine T-celletransduksjon, noe som letter effektiv generering av musens CAR-T-celler.
Abstract
Konstruerte celleterapier som benytter kimære antigenreseptor (CAR)-T-celler har oppnådd bemerkelsesverdig effektivitet hos personer med hematologiske maligniteter og er for tiden under utvikling for behandling av ulike solide svulster. Så langt har den foreløpige evalueringen av nye CAR-T-celleprodukter hovedsakelig funnet sted i xenografttumormodeller ved bruk av immundefekte mus. Denne tilnærmingen er valgt for å legge til rette for vellykket engraftment av humane CAR-T-celler i eksperimentell setting. Syngene musemodeller, der svulster og CAR-T-celler er avledet fra samme musestamme, tillater imidlertid evaluering av nye CAR-teknologier i sammenheng med et funksjonelt immunsystem og omfattende tumormikromiljø (TME). Protokollen beskrevet her tar sikte på å strømlinjeforme prosessen med mus CAR-T cellegenerering ved å presentere standardiserte metoder for retroviral transduksjon og ex vivo T-cellekultur. Metodene beskrevet i denne protokollen kan brukes på andre CAR-konstruksjoner utover de som ble brukt i denne studien for å muliggjøre rutinemessig evaluering av nye CAR-teknologier i immunkompetente systemer.
Introduction
Adoptive T-celleterapier som uttrykker kimære antigenreseptorer (CAR) har revolusjonert feltet kreftimmunterapi ved å utnytte kraften i det adaptive immunsystemet for å spesifikt målrette og eliminere antigen-positive kreftceller: 1. Mens suksessen til CAR-T-celleterapier rettet mot B-cellemaligniteter har blitt klinisk validert, er prekliniske studier utført i dyremodeller fortsatt avgjørende for utviklingen av nye CARer rettet mot solide svulster. Imidlertid har begrenset klinisk effekt blitt vist i solide tumorindikasjoner så langt, og det blir stadig tydeligere at individuelle prekliniske modeller ikke nøyaktig forutsier farmakodynamikken og klinisk effekt av en levende medisin 2,3. Derfor har forskere begynt å utvide den prekliniske studien av CAR-T-celleprodukter til å omfatte parallelle vurderinger i xenograft og syngene modeller av henholdsvis humane og murine kreft.
I motsetning til xenograft-modeller, hvor humane svulster og T-celler er innpodet i immundefekte mus, muliggjør syngene modeller undersøkelse av CAR-T-celleresponser i sammenheng med et funksjonelt immunsystem. Spesielt gir immunkompetente mus som bærer syngene svulster et system for å studere samspillet mellom adoptivt overførte T-celler og kontekstspesifikke miljøer – inkludert tumorassosierte makrofager (TAM) og regulatoriske T-celler (Tregs) kjent for å undertrykke T-cellefunksjon i tumormikromiljøet (TME) 4,5,6. Videre tilbyr syngene modeller en ekstra plattform for å vurdere on-target, off-tumor toksisitet og CAR-T-celleinteraksjon med vertsfaktorer som kan føre til ytterligere toksisitet, inkludert cytokin frigjøringssyndrom7.
Til tross for disse fordelene er antallet syngene CAR-T-cellestudier fortsatt begrenset. Spesielt krever syngene modeller autolog konstruksjon av CAR-T-celler fra samme musestamme og utgjør dermed en ekstra utfordring på grunn av mangelen på metodikk for effektiv murine T-celletransduksjon og ex vivo ekspansjon 2,8. Denne protokollen skisserer metodene for å oppnå stabilt CAR-uttrykk gjennom produksjon av retrovirale vektorer og optimalisert T-celletransduksjon. Et skjema over hele prosessen er vist i figur 1. Bruken av denne tilnærmingen demonstrerer effektiv retroviral transduksjon av murine CAR-T-celler og oppnåelse av høyt CAR-uttrykk uten behov for viral konsentrasjon gjennom ultrasentrifugering. Strategier for å endre antigenspesifisiteten til CAR-konstruksjonen diskuteres i tillegg til samekspresjon av ytterligere transgener.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver trinnene og reagensene som er nødvendige for retroviral transduksjon av murine T-celler for å generere CAR-T-celler for in vivo studier. Optimalisering av retrovirale transduksjonsbetingelser oppnår robust CAR-uttrykk uten behov for viral konsentrasjon gjennom ultrasentrifugering eller ytterligere reagenser. Det er imidlertid flere modifikasjoner som kan brukes på denne metodikken.
Mens denne protokollen beskriver eksempelgenereringen av en GFP-spesifik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker L. Brockmann for kritisk gjennomgang av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH 1R01EB030352 og UL1 TR001873.
Materials
| 0.45 μm filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | 14-955-450 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-135 | |
| 10 mL syringe | BD | 14-823-16E | |
| 100 μm strainer | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC treated cell culture dishes | ThermoFisher Scientific | 130183 | |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 14-959-70C | |
| 40 μm strainer | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 14-959-49A | |
| 70 μm strainer | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | ||
| BALB/C, 6-8 week old | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS), without Calcium and Magnesium | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse T cell Isolation Kit | Stemcell Technologies | 19851 | |
| FACS buffer | BD | BDB554657 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Wolf | 80240M | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15-630-080 | |
| Human recombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| Human recombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| Human recombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | |
| Mouse Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Mouse Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Mouse Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Mouse Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Mouse Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Mouse Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 with Prime 95B camera | Nikon | ||
| Non-treated 24 well plates | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produced by R.LV. | |
| Purified sfGFP | N/A | Produced by R.LV. | |
| RetroNectin ('transduction reagent') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serological pipette 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serological pipette 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serological pipette 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11-360-070 | |
| TC-treated 24 well plates | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan blue | Gibco | 15-250-061 |
References
- June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
- Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
- Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
- Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011 (2020).
- Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
- Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
- Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
- Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203 (2021).
- Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
- Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299 (2021).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , (2023).
- Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
- Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
- Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
- Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
- Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702 (2020).
- Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
- Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
- Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719 (2021).
- Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).
